H9N2亚型禽流感病毒在我国家禽中流行,成为一种家禽常见的地方性流行性疾病。给我国禽类养殖业带来巨大的经济损失。H9N2 AIV已能够突破物种屏障,无需中间宿主直接传染给人,并能够在人体内进一步适应,甚至有可能与人流感病毒发生基因重组,从而给公共卫生安全带来隐患。本文系统分析2017-2019年山东省内的分离鉴定的H9N2 AIVs进行遗传进化及生物学特征,为进一步了解H9N2 AIV的进化、变异规律提供理论依据。1.H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定2017年3月到2019年4月,在山东省10个地区54个活禽交易市场、养殖场及观赏鸟类养殖基地共采集样品3299份。经过PCR实验鉴定,最终确定分离鉴定H9N2AIVs 69份,在不同地点H9N2 AIV的分离鉴定情况有所差异,在活禽市场2486份样品中分离鉴定出H9N2阳性样品57份,在养殖场580份样品中分离鉴定出H9N2阳性样品10份,在观赏鸟类养殖基地采集的233份样品中分离鉴定出H9N2阳性样品2份。从不同宿主分离情况来看,在鸡、鸽子和其他观赏鸟类中鉴定分离H9N2毒株分别为62株、5株和2株,分离鉴定率分别为2.77%、1.29%、0.86%,在鸭子及鹅宿主上没有分离鉴定出H9N2 AIV。不同样品来源的分离鉴定结果显示,在禽类粪便、棉样拭子、临床组织样品以及禽类饮水中的分离鉴定率分别为1.71%、4.27%、5.93%和7.41%。在不同的地区也有不同的分离率,潍坊地区由于采集样品多为临床样品,分离鉴定率最高为13.33%,在济南和东营地区未分离鉴定出H9N2 AIV。2.H9N2 AIVs的遗传进化分析根据不同时间、地点及宿主的不同选取分离纯化的20株H9N2 AIVs进行全基因组序列测定,并将测序序列进行比对分析。结果显示:20株分离株的同源性依次为PB2 95.31-99.87%、PB1 91.16-99.96%、PA 93.82-99。86%、HA 90.97-99.88%、NP 93.45-100%、NA 93-99.93%、M 89.1-100%、NS 96.66-100%。20株分离株共形成18种基因型,所有分离株的HA基因属于Y280亚系,NA、PB1、NP、PA、NS属于F98亚系,PB2、M基因属于G1亚系。通过对20株分离株的内部基因分子特征进行分析表明,20株分离株仍保留低致病性特征,但在影响病毒传播能力的HA 226位点上,所有分离株由Q突变为L;在决定病毒对哺乳动物致病性和传播能力的PB2627位点,13株分离株的627位氨基酸位点为E,仍保留禽源分离株低致病性的分子特征,而7株分离株的627位氨基酸位点为V。3.H9N2亚型禽流感毒的致病性分析经过遗传进化分析筛选5株代表性毒株,4株代表性H9N2 AIV毒株的受体结合特性分析结果表明,不同来源的毒株结合人源受体的能力均高于结合禽源受体的能力。5株代表性H9N2 AIV毒株在小鼠体内的致病性分析表明,毒株CK/2135/17和毒株CK/98/18攻毒的小鼠在攻毒后体重开始下降,分别在第7d和第8d体重达到最小值,分别减少11.8%和13.2%,其余三组小鼠攻毒后体重变化不明显,所有小鼠均未出现死亡现象。5种病毒在小鼠体内有不同的复制能力,均可在小鼠的肺部和鼻甲骨中复制。在小鼠肺中毒株CK/98/18的复制能力最强,病毒滴度达106.7EID50/ml;在小鼠的肾脏中也只检测出毒株CK/98/18,但是病毒复制情况较差,滴度较低。毒株GP/1656/19和毒株CK/98/18均可在鸡的上呼吸道复制,在鸡的气管和肺中均可检测到病毒,并且气管中的病毒滴度要高于肺组织。毒株GP/1656/19和毒株CK/932/18都能在鸡间传播,并在气管和泄殖腔拭子中均检出病毒。但GP/1656/19的传播效率高于CK/932/18病毒。H9N2病毒能诱导鸡快速产生高滴度的特异性抗体,血清HI检测结果均为H9N2病毒阳性,HI抗体滴度在128～2048之间。本研究通过对2017-2019年在山东省内分离的H9N2亚型禽流感病毒进行流行病学及遗传进化分析,揭示了病毒的部分生物学特征,为H9N2禽流感病毒的防控提供重要的依据。