随着再生医学的发展,脂肪间充质干细胞为糖尿病皮肤创面、骨缺损等疾病的治疗提供了一种新的可能,但应用过程中尚存在给药方式受限、定植率不高和细胞存活率低等问题。甲壳素是一种生物活性良好的多功能材料,可用于制备干细胞支架,为干细胞局部应用提供新的方法。然而,目前甲壳素纳米纤维生物学特性、对脂肪间充质干细胞的影响及脂肪间充质干细胞甲壳素纳米纤维水凝胶在急慢性创面中的作用及机制尚有待于进一步研究。针对上述问题,本研究筛选制备甲壳素纳米纤维生物支架,进行材料表征,明确生物学特性;在此基础上采用甲壳素纳米纤维水凝胶培养脂肪间充质干细胞,明确其对脂肪间充质干细胞的影响;最后将脂肪间充质干细胞甲壳素纳米纤维水凝胶用于急性创面和糖尿病创面修复,探索其作用及机制。主要研究结果如下:1.β-甲壳素纳米纤维干细胞支架制备及表征（1）甲壳素纳米纤维悬浮液制备:以鱿鱼软骨为原料,通过酸提取碱纯化方法制备甲壳素纳米纤维悬浮液。该材料具有一定的流动性,扫描电镜下可观察到纳米纤维结构,红外射线、X射线特征峰结果证明该材料为β-甲壳素。（2）不同形态甲壳素纳米纤维干细胞支架制备:甲壳素纳米纤维悬浮液能够与细胞培养基反应形成果冻状凝胶,通过凝胶化反应和抽滤将甲壳素纳米悬浮液制备成凝胶支架和薄膜支架。扫描电镜显示形成凝胶前后均具有多孔结构;流变学检测发现与细胞培养基反应后,甲壳素纳米纤维水凝胶材料强度增加。甲壳素纳米纤维膜经细胞培养基处理后无明显变化,扫描电镜结果显示结构致密。（3）不同形态甲壳素纳米纤维促创面愈合观察:动物实验结果表明,与模型组相比,甲壳素纳米纤维水凝胶能够加速大鼠皮肤全层缺损创面愈合,而甲壳素纳米纤维膜与模型组相比无显著性差异。（4）甲壳素纳米纤维水凝胶生物学评价:甲壳素纳米纤维萃取液干预后12、24和48小时细胞存活率均大于90%,无明显细胞毒性,可用于细胞培养和营养传递;致敏性评价结果表明豚鼠皮肤对该材料无过敏反应;体内降解实验结果表明,甲壳素纳米纤维水凝胶随时间推移逐步被组织包裹并缩小,1个月后基本降解;ELISA检测结果表明,甲壳素纳米纤维水凝胶置于皮下10、20和30天后,周围皮肤组织中白细胞介素-1α（Interleukin-1α,IL-1α）、白细胞介素-4（Interleukin-4,IL-4）和转化生长因子-β（Transforming growth factor-β,TGF-β）表达水平相比于正常对照组相比无明显变化。以上结果说明甲壳素纳米纤维悬浮液能够与培养基进行凝胶化反应,形成的水凝胶具有良好的多孔结构、力学强度和生物学性能的水凝胶,可进一步用于脂肪间充质干细胞培养及促创面愈合研究。2.β-甲壳素纳米纤维水凝胶对脂肪间充质干细胞的影响（1）脂肪间充质干细胞形态观察:普通光学显微镜观察到脂肪间充质干细胞在甲壳素纳米纤维水凝胶中呈球状生长,采用GFP标记脂肪间充质干细胞进行荧光显微镜观察时可见绿色荧光细胞球,进一步证明了上述实验结果;扫描电镜结果发现,脂肪间充质干细胞在甲壳素纳米纤维水凝胶中以细胞球状态均匀分布。（2）脂肪间充质干细胞增殖、迁移和外泌体分泌检测:CCK8检测发现脂肪间充质干细胞在凝胶中能够生长,15天时仍见细胞存活;Transwell实验可见脂肪间充质干细胞从上室凝胶内迁移至下室。透射电镜、纳米颗粒跟踪分析和Western blot检测甲壳素纳米纤维水凝胶培养脂肪间充质干细胞培养上清液,可见外泌体分泌。（3）脂肪间充质干细胞转录组测序及愈合相关因子检测:全转录组测序GO分析富集到细胞分化、细胞周期、细胞粘附、细胞群增殖正向调节、膜基因和蛋白结合等相关基因的变化,为材料优化和干细胞修饰提供参考;KEGG富集进一步发现,与愈合相关的血小板衍生生长因子D（Platelet derived growth factor D,PDGFD）、胰岛素样生长因子1（Insulin-like growth factor 1,IGF1）和TGF-β1等基因的改变;Western blot结果显示,甲壳素纳米纤维水凝胶培养后脂肪间充质干细胞创面愈合相关因子PDGFD、IGF1和TGF-β1的表达升高,与转录组结果一致。以上结果表明,甲壳素纳米纤维水凝胶中脂肪间充质干细胞能够有效增殖、存活和分泌外泌体;甲壳素纳米纤维水凝胶可调控脂肪间充质干细胞中与创面愈合相关因子m RNA和蛋白的表达。3.脂肪间充质干细胞甲壳素纳米纤维水凝胶促急性创面愈合作用及机制（1）脂肪间充质干细胞甲壳素纳米纤维水凝胶促急性创面愈合作用:脂肪间充质干细胞甲壳素纳米纤维水凝胶干预与模型对照、凝胶或脂肪间充质干细胞注射相比能够显著提高大鼠创面愈合率,加速创面组织上皮化,促进新生组织胶原相关蛋白表达和胶原形成,增加血管生成相关蛋白血管内皮生长因子受体（Vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR）和α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）的表达,说明脂肪间充质干细胞甲壳素纳米纤维水凝胶促创面愈合效果优于单一甲壳素纳米纤维水凝胶或脂肪间充质干细胞处理。（2）脂肪间充质干细胞甲壳素纳米纤维水凝胶通过外泌体促创面愈合关键蛋白筛选:以往研究表明,干细胞主要通过细胞分化和外泌体分泌发挥生物活性。针对脂肪间充质干细胞甲壳素纳米纤维水凝胶通过外泌体促创面愈合机制,采用脂肪间充质干细胞外泌体甲壳素纳米纤维水凝胶进行了促大鼠急性创面愈合观察和转录组学及蛋白质组学联合分析,发现脂肪间充质干细胞外泌体甲壳素纳米纤维水凝胶干预后新生创面组织中补体因子D（Complement Factor D,CFD）蛋白和果糖二磷酸醛缩酶A（Aldolase A,Aldoa）蛋白发生改变,并通过Western blot得到了验证。根据脂肪间充质干细胞外泌体甲壳素纳米纤维水凝胶促创面愈合研究结果,采用Western blot对脂肪间充质干细胞甲壳素纳米纤维水凝胶干预大鼠进行促创面愈合关键蛋白检测发现,脂肪间充质干细胞甲壳素纳米纤维水凝胶干预后新生创面组织CFD蛋白和互作Aldoa蛋白表达同样增加。（3）脂肪间充质干细胞外泌体调节关键蛋白Aldoa促进成纤维细胞增殖:以往研究表明,Aldoa与细胞增殖相关,因此我们对脂肪间充质干细胞外泌体进行了体外促增殖作用研究。Western blot结果显示,脂肪间充质干细胞外泌体干预后,L929小鼠成纤维细胞活力增加,细胞中CFD和Aldoa蛋白表达亦增加;通过慢病毒转染抑制L929小鼠成纤维细胞Aldoa蛋白表达后,脂肪间充质干细胞外泌体促L929小鼠成纤维细胞增殖作用减弱。以上结果提示,脂肪间充质干细胞甲壳素纳米纤维水凝胶可能通过脂肪间充质干细胞外泌体调节CFD和Aldoa蛋白表达,加速皮肤成纤维细胞增殖,进而促进大鼠急性创面愈合。4.脂肪间充质干细胞甲壳素纳米纤维水凝胶促糖尿病创面愈合作用及机制（1）脂肪间充质干细胞甲壳素纳米纤维水凝胶促糖尿病创面愈合作用:为进一步探讨脂肪间充质干细胞甲壳素纳米纤维水凝胶对慢性创面的促愈合效果,我们利用db/db糖尿病小鼠建立全层缺损创面模型。采用脂肪间充质干细胞甲壳素纳米纤维水凝胶进行创面干预后,与模型组相比小鼠创面愈合率显著增加,瘢痕减小,肉芽组织形态趋于正常,上皮化形成加速,胶原沉积增多;上皮化形成和细胞增殖相关细胞角蛋白（Cytokeratin）和Ki67蛋白表达显著增加;（2）脂肪间充质干细胞甲壳素纳米纤维水凝胶促糖尿病创面血管生成和细胞外基质重塑,加快创面愈合:除细胞增殖外,血管生成和细胞外基质重塑对糖尿病创面的愈合至关重要,故本部分围绕其进行了进一步研究。ELISA检测发现,脂肪间充质干细胞甲壳素纳米纤维水凝胶能够促进小鼠创面新生组织中血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）、VEGFR、基质金属蛋白酶9（Matrix metalloproteinase 9,MMP9）和基质金属蛋白酶的组织抑制剂-1（Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1,TIMP-1）蛋白的表达。因为Aldoa能够反馈激活低氧诱导因子-1（Hypoxia inducible factor-1,HIF-1α）,因此我们在促急性创面愈合基础上检测了通路蛋白Aldoa和HIF-1α的表达情况,发现脂肪间充质干细胞甲壳素纳米纤维水凝胶能够增加新生组织中Aldoa和HIF-1α蛋白的表达;小鼠皮肤局部给与HIF-1α抑制剂干扰后,HIF-1α及VEGF、VEGFR、MMP-9、TIMP-1蛋白表达水平降低;干扰后脂肪间充质干细胞甲壳素纳米纤维水凝胶处理与未干扰相比创面愈合速度减慢。（3）脂肪间充质干细胞外泌体通过调节HIF-1α/MMP9促进细胞迁移:HIF-1α影响MMP-9表达在细胞迁移中具有重要作用,故围绕脂肪间充质干细胞外泌体对成纤维细胞迁移的影响进行了深入研究。细胞划痕和Transwell实验结果表明,脂肪间充质干细胞外泌体干预后,L929小鼠成纤维细胞迁移能力增加;用HIF-1α抑制剂进行干扰后脂肪间充质干细胞外泌体促L929小鼠成纤维细胞的迁移作用减弱。以上结果表明,脂肪间充质干细胞甲壳素纳米纤维水凝胶能够促进小鼠糖尿病创面愈合,除促细胞增殖外,其可能通过调节Aldoa反馈激活HIF-1α/MMP9通路,促进细胞迁移,进而加快糖尿病创面血管生成和细胞外基质重塑。综上所述,本研究制备了脂肪间充质干细胞β-甲壳素纳米纤维水凝胶,并探讨了其在急慢性创面愈合中的作用及初步机制。研究结果为脂肪间充质干细胞培养和解决急慢性创面救治的难题奠定新的理论基础。