目的建立人胎儿角膜上皮细胞体外原代培养和传代培养方法,优化人胎儿角膜上皮细胞的培养体系,为构建组织工程角膜提供上皮种子细胞。方法一、人胎儿角膜上皮原代和传代培养1、原代培养严格无菌操作获取人胎儿角膜片,采用组织块贴壁法(角膜缘部、中央部)、酶消化法原代培养人胎儿角膜上皮细胞。2、传代培养角膜缘部的细胞生长融合达80%以上,不同稀释浓度的胰酶/EDTA消化液消化传代分别接种于空板、小鼠3T3成纤维细胞饲养层、胎儿角膜基质细胞饲养层及HTK饲养层,培养液分别采用D/F12、小鼠3T3成纤维细胞条件培养液、胎儿角膜基质细胞条件培养液、HTK条件培养液。二、人胎儿角膜上皮细胞培养体系的条件优化1、三种条件培养液蛋白含量测定与细胞增殖检测将收集的小鼠3T3成纤维细胞条件培养液、胎儿角膜基质细胞条件培养液、HTK条件培养液使用BCA蛋白定量试剂盒测定样品的蛋白含量。设D/F12为对照组,MTT法检测3T3条件培养液、胎儿角膜基质细胞条件培养液、HTK条件培养液对人角膜上皮细胞系的增殖能力。2、牛角膜细胞破碎液蛋白含量测定与细胞增殖检测将收集的牛角膜上皮细胞、基质细胞及内皮细胞三种细胞破碎液原液使用BCA蛋白定量试剂盒测定样品的蛋白含量。设D/F12为对照组,MTT法检测含5%、10%、20%不同浓度的三种牛角膜细胞破碎液对人角膜上皮细胞系的增殖能力。三、人胎儿角膜上皮细胞的性质鉴定将P3代人胎儿角膜上皮细胞用K3/12抗体进行荧光染色,观察传代细胞是否还保持有角膜上皮细胞的特性。收集P3代人胎儿角膜上皮细胞总RNA,用角膜基质细胞作为阴性对照,检测K12、Pax6、K15、ABCG2和P75在mRNA水平上的表达情况。结果一、人胎儿角膜上皮细胞的生长情况观察1、原代培养角膜缘部组织块周围迁出的细胞以圆形或卵圆形为主,排列紧密,生长状态良好;中央部的角膜上皮细胞体积大,以大而扁平的类表层上皮细胞为主,生长状态差;消化法培养可观察到上皮消化成单细胞悬液,但接种后无细胞贴壁。2、细胞传代观察不同浓度消化液消化传代的细胞发现,采用0.05%胰酶+0.02%EDTA消化可观察到消化后的细胞大部分成单细胞状态,传代培养后细胞贴壁及增殖良好。接于HTK饲养层和胎儿角膜基质细胞饲养层上的细胞不易贴壁且细胞不增殖,接于3T3饲养层上的细胞克隆生长,增殖能力强,但继续传代后细胞老化,不再增殖,容易有角膜基质细胞污染。采用D/F12、HTK条件培养液及胎儿角膜基质细胞条件培养液培养,细胞增殖能力弱,逐渐老化,不能继续传代;采用3T3条件培养液培养,培养3天后,可见形态规则的卵圆形小细胞集落分布于不规则的大细胞间,细胞增殖能力强。传至P4代胎儿角膜上皮细胞仍有较强增殖能力,但小细胞明显减少。二、人胎儿角膜上皮细胞培养体系的条件优化1、三种条件培养液对人角膜上皮细胞增殖的影响用BCA蛋白定量试剂盒对3T3条件培养液、胎儿角膜基质细胞条件培养液、HTK条件培养液进行蛋白含量测定,结果显示3T3条件培养液组蛋白含量最高。MTT法检测结果显示3T3条件培养液可明显促进HCEC的增殖,其与胎儿角膜基质细胞条件培养液、HTK条件培养液和D/F12三组差异均有显著的统计学意义。2、三种牛角膜细胞破碎液对人角膜上皮细胞增殖的影响用BCA蛋白定量试剂盒对牛角膜上皮、基质及内皮细胞破碎液液体进行蛋白含量测定,结果显示牛角膜上皮细胞破碎液为914μg/ml,牛角膜基质细胞破碎液为953μg/ml,牛内皮细胞破碎细胞液为1252μg/ml。MTT法检测结果显示5%的牛上皮细胞破碎液、5%、10%牛基质细胞破碎液、10%牛内皮细胞破碎液均可明显促进HCEC的增殖,四组与D/F12之间差异有显著的统计学意义,四组间差异无统计学意义。三、人胎儿角膜上皮细胞的性质鉴定1、免疫荧光染色可见P3代的人胎儿角膜上皮细胞K3/12染色阳性。2、RT-PCR检测显示,P3代人胎儿角膜上皮细胞在mRNA水平上有K12、K15、Pax6、P75和ABCG2的高表达,而角膜基质细胞表达较弱。结论一、组织块贴壁法原代培养人胎儿角膜上皮细胞以及小鼠3T3成纤维细胞条件培养液传代培养方法基本建立;二、人胎儿角膜缘部上皮细胞增殖能力优于中央部;三、3T3细胞条件培养液能促进角膜上皮细胞的增殖。