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阿维菌素(Avermectin)是由阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)产生的一类结构相似的十六元大环内酯齐墩果糖双糖衍生物,阿维菌素具有广谱、高效的抗寄生虫活性,对宿主不良反应极低,是目前理想的驱虫、杀虫药物。但阿维链霉菌在发酵过程中产生8个阿维菌素组分,其中只有B1a组分的活性最高,因此,如何去除无用组分,提高有效组分B1a的含量已成为世界各国竞相研究的热点。 本论文探索性地对影响阿维菌素组分的关键基因aveC基因和aveD基因进行了基因改造。 aveC基因编码阿维菌素生物合成的脱水酶,提高该基因的表达量可以提高有效组分“1”的比例。本论文采用基因工程的方法在阿维链霉菌的基因组DNA中增加了一套aveC基因拷贝,期望通过增加基因的拷贝数增强脱水酶的活性。对重组菌株PCR检验的结果表明,第二套aveC基因正确地插入到了基因组DNA的预定部位。然而,对重组菌株发酵产物的HPLC分析显示,阿维菌素“1”组分含量并没有明显的变化,提示该脱水酶的活性可能不是阿维菌素生物合成的限制因素。 aveD基因是编码阿维菌素C5-O-甲基转移酶的基因,该酶催化阿维菌素“B”组分转化成为无用的“A”组分。为了去除无用的产物“A”组分,本论文采用了插入抗性基因的方法构建了aveD基因失活的重组质粒pCG23,并将该质粒转入阿维链霉菌AVD2-14中,得到重组菌株AV-C337。发酵结果显示重组菌株AV-C337仅产生阿维菌素B2a和B1a两个组分,彻底去除了无用的“A”组分,但重组菌株的产量较低。 为了避免插入较大外源基因可能造成的产量降低,本论文还采用了PCR扩增的方法,在aveD基因中引入突变,删除了aveD基因中5个保守的氨基酸序列,得到重组质粒pCG29。将其转入阿维链霉菌AV-C337中,通过同源双交换得到了缺失5个氨基酸的aveD基因失活阻断变株AV-C519。然而发酵结果表明,该阻断变株阿维菌素的产量也显著降低。因此,如何避免基因插入失活后代谢产物产量的降低,依然是个需要探索和解决的问题。