N-乙酰神经氨酸（Neu Ac）,又称燕窝酸或唾液酸,是哺乳动物中发现的唾液酸类化合物中最主要的一种,对于改善大脑发育和认知、增强免疫功能等具有重要作用,已被广泛用作营养化学品和药物中间体。同时,以Neu Ac为合成前体的多种化合物,特别是唾液酸基母乳寡糖,在营养强化剂领域有重要应用。目前,Neu Ac的工业化生产方法主要为提取法和全细胞催化法,存在成本高、污染环境和引入过敏原等固有缺陷。因此开发高效合成平台化合物Neu Ac的微生物底盘细胞对于各类以Neu Ac为合成前体的多种化合物高效生物合成方法的拓展具有重要意义。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作为一种食品安全微生物,通过代谢工程改造能够高效合成Neu Ac前体N-乙酰氨基葡萄糖（Glc NAc）,是适合进行Neu Ac高效合成的底盘细胞。本课题以本研究室构建的一株产Neu Ac枯草芽孢杆菌B6CG作为出发菌株,通过基因表达工具箱的完善、限速步骤的解析与消除、生长生产的平衡调控与合成途径的替换优化四个方面,开展高效合成Neu Ac枯草芽孢杆菌底盘细胞的构建。主要研究内容如下:（1）通过枯草芽孢杆菌转录组与蛋白组数据分析,获得潜在594个不同强度N-端编码序列（NCS）。从中选取96个,使用绿色荧光蛋白（GFP）表达水平进行验证,初步获得了荧光强度跨越4个数量级的NCS文库,使GFP表达水平在使用强启动子P43的基础上提高至6.95倍。根据添加不同NCS后荧光强度曲线变化特征,将NCS分为生长偶联型、迟滞表达型、持续表达型和强烈抑制型。通过统计学分析发现,目前已经提出的五种机制:N端规则、m RNA二级结构、热力学和动力学、A-T含量和带电荷的氨基酸含量都难以用于预测和设计NCS。通过分析发现特定氨基酸的丰度与蛋白表达水平显著相关,因此对NCS进行了理性设计,使GFP表达水平在使用强启动子P43的基础上提高至8.47倍,实现了通过理性改造上调或下调目的基因表达水平。为了实现NCS的自动高效设计,开发了网站用于NCS的自动设计（http://www.wjiangnan.com/dna/）。（2）分别使用天然NCS与人工设计NCS强化强启动子Plyt R调控的关键酶氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰基转移酶（GNA1）的表达,使Neu Ac产量从0.8 g/L提升至2.0 g/L。然后基于Michaelis-Menten方程与Neu Ac代谢途径,构建了由底物葡萄糖合成目标产物Neu Ac的动力学模型,共包含13步酶促反应和26个酶促反应动力学参数。通过动态模拟,分析获得Neu Ac合成途径中的两个潜在关键限速靶点是6-磷酸果糖激酶（Pfk A）和丙酮酸激酶（Pyk）。为了快速验证限速步骤,通过在无细胞合成体系中外源添加不同中间代谢产物,发现当添加磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）时,Neu Ac产量从0.3 g/L显著提升至0.6 g/L,验证了动力学模型预测结果。因此,利用NCS对关键基因pfk A与pyk进行表达下调与动态表达调控,Neu Ac产量提高了80.0%,达到3.6 g/L。（3）针对Neu Ac合成底盘细胞生长与产物合成之间不平衡的问题,在枯草芽孢杆菌中构建了密码子扩展技术,通过表达非天然氨基酸氨酰t RNA合成酶和t RNA突变体（Mut RNA）,实现了基因表达的翻译过程中对于TAG终止密码子的识别和非天然氨基酸（O-甲基酪氨酸,OMe Y）的掺入。通过Mut RNA启动子突变文库高通量分选、拷贝数优化与合成启动子测试,构建了基于添加非天然氨基酸的基因表达精准调控工具,可实现基因表达80倍激活。利用OMe Y的添加分别控制枯草芽孢杆菌细胞生长关键酶UDP-N-乙酰基丙酮酰氨基葡萄糖还原酶（Mur B）、双组分系统调节蛋白（Wal R）和磷脂酸胞苷转移酶（Cds A）的表达,实现了重组菌株细胞生长的精确调控,最优细胞生长与产物合成平衡条件下Neu Ac产量提高33.3%,达到4.8 g/L。同时,使用密码子扩展获得的底盘细胞不添加OMe Y时,逃逸率低于3.67?×?10-10?（escapees/c.f.u.）,避免了重组菌株在自然界中繁殖,实现了重组菌株高效生物封存（Biocontainment）。（4）针对中间代谢物N-乙酰氨基葡萄糖（Glc NAc）与N-乙酰甘露糖（Man NAc）大量积累的问题,首先重构并优化了无Glc NAc生成的UDP-Glc NAc差向异构酶（Neu C）途径,并对Neu Ac合成直接前体物质UDP-Glc NAc合成的关键酶谷氨酰胺果糖-6-磷酸氨基转移酶（Glm S）、磷酸氨基葡萄糖变位酶（Glm M）和UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶（Glm U）使用不同强度启动子进行优化,消除了中间代谢物Glc NAc,使Neu Ac产量提升96.7%至5.9 g/L。其次,为了降低中间代谢物Man NAc的积累,通过N-乙酰神经氨酸合酶（Neu B）定向进化、不同来源Neu B共表达与PEP供给强化,Man NAc降低46.3%,从4.1 g/L降至2.2 g/L,同时Neu Ac产量提升54.9%,至7.9 g/L。最后,使用本文建立的基于密码子扩展的方法,进行细胞生长与产物合成的平衡调控,在3 L发酵罐补料分批发酵中Neu Ac最大产量为21.8 g/L,得率为0.04 g/g葡萄糖,生产强度为0.34 g/L/h,且生产强度达到目前报道最高水平。