背景随着人口老龄化趋势的加重和肥胖人群的增加,糖尿病的患病人数正在迅速增长。糖尿病已成为严重威胁人类健康的慢性非传染性疾病之一。糖尿病不仅是导致失明、肾衰竭和下肢截肢的主要病因,而且也是心脑血管疾病发生的主要风险因素。大量研究表明,微小RNA(microRNA,miRNA)与2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)的发生、发展及并发症的出现密切相关,因此寻找新的miRNA并阐明其在T2DM病变过程中的作用及其机制有助于T2DM的早期诊断和治疗。目的鉴定miR-152-3p是否可作为T2DM临床早期诊断的分子标志物,初步探究miR-152-3p在T2DM胰岛素抵抗发生中的作用及其分子机制。方法1.分析miR-152-3p在正常人和T2DM患者外周血中的表达情况按照T2DM诊断标准,收集正常人群及无明显并发症的T2DM患者的晨起空腹外周血液,抗凝处理后保存备用。使用RT-PCR技术鉴定两组人群中miR-152-3p分子表达水平的差异,分析miR-152-3p表达水平与个体空腹血糖水平和个体体质指数等指标之间的相关性。2.研究过表达miR-152-3p对小鼠糖代谢及代谢相关基因表达的影响高脂饮食喂养C57BL/6N雄性小鼠,诱导胰岛素抵抗小鼠模型(diet induced obesity,DIO组),以正常饮食喂养小鼠作为对照(Chow组)。喂养至12周时,每种模型小鼠随机分成两组,禁食6小时后注射过表达miR-152-3p的腺病毒或对照病毒,检测小鼠随机血糖、葡萄糖耐量、丙酮酸耐量和胰岛素耐量的变化情况。注射10天后,禁食12小时后麻醉处死小鼠,使用RT-PCR和蛋白免疫印迹等技术,检测小鼠肝脏中胰岛素信号通路和糖异生等相关基因在mRNA和蛋白水平的变化情况。3.研究抑制内源性miR-152-3p对小鼠糖代谢及代谢相关基因表达的影响构建胰岛素抵抗小鼠模型,以正常小鼠作为对照。注射抑制miR-152-3p功能的腺病毒或对照病毒,检测小鼠随机血糖、葡萄糖耐量、丙酮酸耐量和胰岛素耐量的变化情况。注射10天后,禁食12小时后麻醉处死小鼠,使用RT-PCR技术和蛋白免疫印迹实验,检测小鼠肝脏中胰岛素信号通路和糖异生等相关基因在mRNA和蛋白水平的变化情况。4.生物信息学方法寻找miR-152-3p的潜在靶基因将miR-152-3p过表达处理组(DIO-miR-152)和对照处理组(DIO-NC-miR)胰岛素抵抗小鼠的肝脏组织,进行转录组深度测序分析,检测肝脏组织中基因在转录水平的变化情况;同时结合miRNA靶基因预测软件,寻找可能受到miR-152-3p调控作用并与糖尿病发生相关的潜在靶基因。5.分析miR-152-3p对靶基因表达的调控作用(1)分析靶基因 mRNA 的 3’-非翻译区域(3’-untranslated region,3’-UTR),确定其是否与miR-152-3p种子区存在潜在结合位点。使用分子克隆技术,将含有靶基因mRNA 3’-UTR部分序列的cDNA片段,克隆入pmirGLO双荧光素酶报告基因载体构建重组载体。此后将重组载体分别与miR-152-3p模拟物(miR-152-3p-agomir)或NC-agomir共转染入HepG2细胞,转染后进行双荧光素酶基因报告实验,检测不同处理组细胞荧光素酶活性的变化情况,确定miR-152-3p对靶基因的直接调控作用。(2)在小鼠肝癌细胞Hepal-6中分别转染miR-152-3p-agomir,miR-152-3p-antagomir(miRNA拮抗剂)及其阴性对照。使用RT-PCR技术,检测过表达或抑制miR-152-3p后细胞中靶基因mRNA水平的变化情况。同时在小鼠肝癌细胞中共转染过表达靶基因的载体和miR-152-3p-agomir,或共转染靶向靶基因的siRNA和miR-152-3p-antagomir,使用蛋白免疫印迹技术检测miR-152-3p对其靶基因蛋白表达水平的影响。(3)使用RT-PCR技术,检测过表达和抑制miR-152-3p后胰岛素抵抗小鼠肝脏组织中靶基因mRNA水平的变化情况。结果1.miR-152-3p在T2DM患者外周血中表达水平降低与健康人群相比,miR-152-3p在T2DM患者外周血中的表达水平明显降低,并与两组人群的体质指数和空腹血糖指数呈明显负相关。2.过表达miR-152-3p对小鼠糖代谢及代谢相关基因表达的影响过表达miR-152-3p后,正常小鼠的血糖水平未见明显改变,而胰岛素抵抗小鼠的空腹血糖和随机血糖水平较对照组降低,对葡萄糖和丙酮酸的耐受能力以及对胰岛素的敏感性都明显增强。肝组织中胰岛素信号通路关键基因IRS2的mRNA水平明显升高;糖异生相关基因FBP1和PCK1的mRNA水平发生降低;脂肪合成相关基因ACC1的mRNA水平发生升高。胰岛素信号通路中PI3K和GSK3β蛋白的磷酸化水平升高;相反,糖异生关键蛋白PCK1的表达水平降低。3.抑制内源性miR-152-3p对小鼠糖代谢及代谢相关基因表达的影响抑制内源性miR-152-3p功能后,正常小鼠和胰岛素抵抗小鼠的葡萄糖代谢能力下降,对胰岛素的敏感性降低,糖异生能力明显增强;此外,胰岛素抵抗小鼠的肝重/体重比值下降,肝糖原含量无明显变化,小鼠血浆中胰岛素的水平明显升高;胰岛素信号通路中关键基因AKT2及脂肪合成相关基因ACC1的mRNA水平均发生下降。4.生物信息学方法寻找miR-152-3p的潜在靶基因通过转录组测序分析,我们发现DIO-miR-152处理组胰岛素抵抗小鼠肝脏中早期生长应答蛋白 1(Early growth response protein 1,EGR1)基因在 mRNA水平明显降低。miRNA靶基因预测分析也发现,EGR1基因mRNA的3’-UTR区含有与miR-152-3p序列互补的潜在位点。5.miR-152-3p能够调控靶基因EGR1的表达(1)双荧光素酶基因报告实验结果显示,过表达miR-152-3p能够降低EGR1重组载体荧光素酶的活性,说明小鼠EGR1是tmiR-152-3p的直接靶基因。(2)细胞实验结果表明,过表达miR-152-3p能够降低EGR1基因的mRNA的水平;相反,使用miRNA抑制剂螯合内源性miR-152-3p功能后,EGR1基因的mRNA水平明显升高。此外,在过表达miR-152-3p抑制EGR1基因表达的基础上,同时使用miR-152-3p抑制剂,会削弱过表达miR-152-3p对EGR1基因表达的抑制作用。同时,在细胞内过表达miR-152-3p能够降低EGR1的蛋白表达水平;相反,干扰内源性miR-152-3p功能后,EGR1的蛋白水平明显升高。(3)在胰岛素抵抗小鼠中过表达miR-152-3p可以明显降低肝脏组织中EGR1基因的mRNA水平。相反,干扰miR-152-3p功能会上调EGiR1基因的mRNA水平。因此,可以确定EGR1是miR-152-3p的直接靶基因。结论miR-152-3p在T2DM患者外周血中表达水平降低,并与健康人群和T2DM患者的体质指数和空腹血糖指数呈明显负相关。miR-152-3p表达水平降低可能是胰岛素抵抗及T2DM发生的重要标志。过表达或抑制miR-152-3p功能能够通过增强或抑制胰岛素信号通路相关基因的表达,改善或加重小鼠的胰岛素抵抗。miR-152-3p可能通过干扰靶基因EGR1的表达发挥抑制胰岛素抵抗或T2DM发生的作用。