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硫化氢(H2S)已经被证实是继一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)之后的第三种气体信号分子。在哺乳动物中,它参与了血管舒张、胰岛素分泌、炎症反应、细胞周期以及伤害应激反应等多方面的重要生理过程,是一个分布广泛、功能多样的信号分子。高等植物中NO和CO已经被证实是重要的信号分子,与动物中的功能有诸多类似之处,而H2S的研究草创伊始。早在1978年,就有报道在玉米、菜豆中检测到内源H2S的释放。之后关于H2S的研究,仅仅止步于现象的观察和简单生理生化指标的测定,未从“气体信号分子”这一全新的视角去发掘。直到最近,出现了一些关于植物H2S信号参与非生物胁迫抗性、抗氧化胁迫、根形态建成和种子萌发等方面的报道。 哺乳动物中内源H2S产生的关键酶是以半胱氨酸为底物并依赖于pyridoxal-5-phosphate(PLP)的cystathionineγ-lyase(CSE)和cystathionineβ-synthase(CBS)两种酶。模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中已经克隆了一些与内源H2S产生直接相关的基因:L型半胱氨酸脱巯基酶编码基因(LCD)和D型半胱氨酸脱巯基酶编码基因(DCD),这两个基因合称CDes。之后也有一些功能类似或相关的酶被报道,但研究不深入。 本论文主要集中分析气体信号分子H2S在拟南芥应答干旱胁迫过程中的作用和机制。主要结果如下: 1.内源H2S生成关键酶编码基因CDes的表达具有明显的发育时期特异性和组织特异性,其表达量随着苗龄逐渐增加,在茎和茎生叶中明显高于根、莲座叶和花器官;干旱胁迫条件下,CDes与干旱相关基因的表达模式相似,且生理浓度H2S外源处理可以进一步刺激干旱相关基因表达;干旱胁迫能显著诱导植物体内H2S的产生,复水后内源H2S产率下降;生理浓度外源H2S处理的幼苗在干旱胁迫下表现出较高的成活率,且叶片的气孔孔径与对照组相比显著减小。 2.H2S的缺失能够显著抑制干旱胁迫下拟南芥种子的萌发;显著增加拟南芥幼苗体内的H2O2和MDA含量。对野生型WT和突变体lcd干旱胁迫前后的生理指标测定表明:干旱胁迫前,lcd的POD、CAT、SOD和APX的活性与WT相比没有显著差异;干旱胁迫后,lcd的抗氧化酶活性均升高,较胁迫前有极显著差异;与WT相比酶活较高,且差异极显著。 3.H2S关键酶编码基因LCD的突变体lcd体内,外向K+通道、阴离子通道和Ca2+通道的编码基因表达量下调,内向K+通道编码基因的表达量上调;生理浓度的H2S处理使aba3和abi1的气孔孔径显著减小,而ABA处理lcd未引起显著的气孔关闭;ABA受体编码基因的表达量在lcd中上调,外源H2S处理后则表现为下调;aba3和abi1中LCD表达量和H2S产率均降低,ABA合成限速酶编码基因在lcd中的表达量与WT相比变化不明显;生理浓度的外源H2S处理可激活保卫细胞的阴离子通道。 4.检测了PEG-8000模拟干旱条件下拟南芥幼苗干旱相关miRNAs的转录水平和H2S产率变化。结果显示:miRNAs的转录水平发生显著变化;内源H2S产生速率显著增加;外源H2S处理引起WT的干旱相关miRNAs的转录水平变化;同时,H2S和干旱胁迫处理还能引起的miRNAs靶基因转录水平的变化;上述结果均在lcd突变体中得到了验证。 综上所述,本文以拟南芥Col-0生态型、L-型半胱氨酸脱巯基酶编码基因突变体lcd、ABA合成缺陷型突变体aba3和ABA反应敏感型突变体abi1为实验材料,利用半定量和荧光定量PCR、荧光显微技术、T-DNA插入突变技术、膜片钳等技术,从表型、组织器官形态、生理、细胞及分子等多个层次,对气体信号分子H2S在拟南芥应答干旱胁迫过程中的作用和机制进行了研究。结果表明:H2S可以通过对离子通道和气孔运动的调节、与ABA信号的相互作用、对体内抗氧化酶系统的影响以及对干旱胁迫相关miRNAs的转录调控等途径,影响拟南芥应对干旱胁迫的能力。全文系统分析了植物体内气体信号分子H2S产生的酶学来源及其应对胁迫的生理功能;证明了干旱胁迫中H2S的信号作用;明确了在干旱胁迫过程中H2S与ABA的相互作用;探明了H2S通过激活离子通道以调节气孔运动,从而增强植物对干旱胁迫的耐受性这一分子机制。为H2S在植物体内信号功能的研究提供了更清晰的证据。