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在工业化国家,缺血性心脏病是主要的死亡原因。目前针对冠心病的主要治疗手段,包括溶栓、介入治疗、冠状动脉搭桥手术等,均是对缺血心肌实施再灌注,而再灌注也会造成心肌细胞的损伤。缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤成为阻碍缺血心肌从再灌注疗法中获得最佳疗效的主要难题。既往研究表明,各种不同的PPARγ(peroxisomeproliferator-activated receptor-γ,过氧化物酶体增殖物激活受体γ)激动剂(包括罗格列酮、曲格列酮和吡格列酮等)都可以减少心肌缺血再灌注损伤,发挥类似IPC(ischemia preconditioning,缺血预处理)的作用,并对其机制作了一定的研究。本研究利用原代培养的大鼠心肌细胞、急性分离的大鼠心肌细胞及成年大鼠,在既往研究的基础上进一步探讨PPARγ激动剂吡格列酮预处理抗大鼠心肌缺血再灌注损伤的机制。1.目的1.1.观察KATP(ATP-sensitive potassium channel,ATP敏感性钾通道)在吡格列酮抗大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用;1.2.观察吡格列酮对急性分离大鼠心室肌细胞KATP电流的影响;1.3.观察在大鼠心肌缺血再灌注损伤时心肌ERK1/2、磷酸化ERK1/2、p38、磷酸化p38、TGFβ1、COX-2及HIF-1α表达的变化及吡格列酮对其影响。2.方法2.1.利用原代培养的新生SD(sprague-Dawley)大鼠心肌细胞,分别予以0.1、1.0、2.0μM浓度吡格列酮预处理24h,同时分别予以特异性PPARγ受体阻断剂GW9662、sarcKATP(sarcolemmal ATP-sensitive potassiumchannel,肌膜ATP敏感性钾通道)阻断剂HMR-1098和mitoKATP(mitochondria ATP-sensitive potassium channel,线粒体敏感性钾通道)阻断剂5-HD(5-Hydro-xydecanoate,5-羟葵酸)处理后,建立缺氧复氧模型,Annexin V-FITC/PI双染法及Hoechst33258染色法检测心肌细胞凋亡;收集心肌细胞,利用免疫印迹方法、RT-PCR方法检测两种KATP亚单位Kir(inwardly rectifying K channel,内向整流钾通道)的表达。2.2.急性分离成年SD大鼠心肌细胞,细胞缺氧后记录KATP电流,观察不同浓度吡格列酮灌流细胞后对电流的影响;2.3.成年SD大鼠30只,分组后分别予以5、10、20mg·kg-1·d-13种浓度吡格列酮灌胃×7d,灌胃后在体建立心肌缺血再灌注损伤模型:结扎冠状动脉前降支30min,复灌30min,留取心肌组织,利用免疫印迹方法、RT-PCR方法检测ERK1/2、磷酸化ERK1/2、p38、磷酸化p38、TGFβ1、COX-2及HIF-1α表达的变化及吡格列酮对其影响。3.结果3.1.缺氧复氧后心肌细胞早期凋亡率升高(由空白组的0.20±0.03%增加至12.22±1.45%,P<0.05),吡格列酮减少心肌细胞凋亡(各剂量组分别为10.09±0.67%、9.16±1.47%、8.32±0.89%),仅2.0μM组与缺氧复氧组比较有统计学差异(P<0.05)。PPARγ受体阻断剂GW9662阻断2.0μM吡格列酮抗心肌细胞凋亡的作用(12.46±1.62%,P<0.05);3.2.mitoKATP阻断剂5-HD削弱吡格列酮抗心肌细胞凋亡的作用(凋亡率10.00±0.50%,P<0.05),sarcKATP阻断剂HMR-1098无明显影响(8.74±1.59%,P>0.05);3.3.吡格列酮上调mitoKATP亚单位Kir6.1 mRNA及蛋白的表达,PPARγ受体阻断剂GW9662削弱这种上调作用;吡格列酮对sarcKATP亚单位Kir6.2 mRNA表达无明显影响;3.4.在急性分离成年SD大鼠心肌细胞,细胞缺氧后成功诱发出ATP敏感性钾电流,不同浓度吡格列酮灌流细胞后对电流无明显影响;3.5.缺血再灌注后,大鼠心肌ERK1/2、p38蛋白表达无明显变化,磷酸化ERK1/2、磷酸化p38、TGFβ1、COX-2、HIF-1α表达上调;吡格列酮对ERK1/2表达无明显影响,上调磷酸化ERK1/2表达;对p38表达无明显影响,下调磷酸化p38的表达;上调TGFβ1mRNA、蛋白表达;上调COX-2 mRNA、蛋白表达;上调HIF-1αmRNA表达。4.结论4.1.吡格列酮预处理减轻心肌细胞缺氧复氧后凋亡,这种作用部分通过激活PPARγ途径实现;4.2.吡格列酮可能通过上调mitoKATP通道亚单位表达、诱导mitoKATP开放发挥抗心肌细胞凋亡作用,sarcKATP未参与这种保护过程;4.3.吡格列酮抗心肌缺血再灌注损伤可能与调节RISK(Reperfusion InjurySalvage Kinase,再灌注损伤救援激酶)的表达有关。