论文部分内容阅读
阿尔兹海默病（AD）是一种衰老相关疾病，APP+转基因鼠模型能良好模拟AD的临床特征。AD的主要表现为进行性学习记忆能力减退、空间认知功能障碍以及人格和行为改变等症状。有关间充质干细胞移植治疗APP+转基因鼠的研究比较广泛但其机制尚不明确。Sirt2作为长寿蛋白sirtuins家族成员，可通过调控细胞周期参与营养代谢、衰老及凋亡等多种细胞活动的调节，但其是否可作为治疗神经系统退行性疾病如AD的分子靶标尚无定论。目的通过构建高表达人类沉默信息调节因子2（Sirt2）基因且含有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记的重组腺病毒研究Sirt2基因对人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）衰老的影响；并通过体内实验探讨Sirt2高表达的hUC-MSCs移植对APP+转基因模型鼠的抗衰老作用及其作用机制。方法提取hUC-MSCs总RNA并将其反转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR反应扩增人Sirt2ORF序列，将目的基因插入腺病毒穿梭质粒（pAdTrack-CMV）中构建出阳性重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-Sirt2；PmeI单切使重组穿梭质粒线性化并将其转化进入BJ5183大肠杆菌感受态细胞中与腺病毒骨架质粒（pAdEasy1）同源重组从而获得重组腺病毒载体pAd-Sirt2；PacI单切使重组腺病毒载体pAd-Sirt2线性化，利用脂质体LipofectamineTM2000将线状pAd-Sirt2重组载体转染至HEK293细胞中扩增和包装出重组腺病毒pAd-Sirt2；逐空稀释法测定重组腺病毒滴度。用包装成功的重组腺病毒pAd-Sirt2感染衰老型P15代hUC-MSCs，以未感染腺病毒的细胞为对照组，CCK-8测定细胞生长曲线，流式细胞术检测细胞周期变化，Western Blot检测衰老相关基因P21、P16、P53、PCNA、Sirt2的表达变化；最后用重组腺病毒pAd-Sirt2感染P3代hUC-MSCs获得感染组细胞，收集感染组细胞并将其移植进入APP+转基因模型鼠体内，三周后采用Morris水迷宫法检测模型小鼠学习记忆能力变化，TBA法检测血清丙二醛（MDA）含量、羟胺法检测血清超氧化物歧化酶（SOD）活性变化，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测衰老相关基因P21、P16、P53、PCNA、Sirt2的mRNA表达变化，Western Blot检测衰老相关基因P21、P16、P53、PCNA、Sirt2的蛋白表达变化。结果1、P2和P15hUC-MSCs中Srit2的表达存在差异，与P2代细胞相比，P15代细胞Sirt2基因表达明显降低。2、利用重组腺病毒包装系统，成功构建pAd-Sirt2重组腺病毒载体，并包装、扩增包含人Sirt2基因的重组腺病毒pAd-Sirt2，获得滴度约为1.8×1011pfu/L的病毒上清。3、重组腺病毒感染P15代hUC-MSCs后，在荧光倒置显微镜下可明显看到GFP的表达；CCK-8检测发现高表达Sirt2能够明显促进细胞增殖；流式细胞术检测发现高表达Sirt2组G0/G1期细胞明显减少，细胞分裂期明显延长；WesternBlot检测显示高表达Sirt2组细胞衰老正相关基因P21、P16、P53蛋白水平下降，衰老负相关基因PCNA、Sirt2蛋白水平上升。4、重组腺病毒感染P3代hUC-MSCs并移植进入老年痴呆症APP+转基因模型鼠，通过Morris水迷宫实验进行行为功能学检测，与APP+鼠对照组相比，高表达Sirt2细胞移植组APP+鼠学习记忆能力明显提高；血清中SOD活性明显升高，MDA含量明显降低；通过qRT-PCR及Western Blot检测，高表达Sirt2细胞移植组APP+鼠脑及心肝脾肺肾各组织中衰老正相关基因P21、P16、P53的表达在mRNA和蛋白水平均显著下降，衰老负相关基因PCNA、Sirt2的表达水平上升。结论P2和P15hUC-MSCs中Srit2的表达存在差异，Sirt2与衰老呈负相关；体外成功构建含有人Sirt2基因的重组腺病毒，并包装获得病毒上清；高表达Sirt2能明显延长P15代hUC-MSCs细胞分裂期并促进细胞增殖及减少细胞衰老正相关基因的表达，延缓细胞衰老；APP+转基因小鼠经高表达Sirt2人脐带间充质干细胞静脉移植治疗后，学习记忆能力显著提高，抗衰老作用明显，P21、P16、P53等基因的表达较对照组明显降低，而PCNA、Sirt2等基因表达增高；这些衰老相关基因之间密切联系，可能构成细胞衰老的基因调控链。