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1．研究背景
晚期胃癌缺乏有效的治疗方法，预后不佳，有必要寻找新的治疗手段和药物。缺氧是促进恶性肿瘤发展的关键因子之一，可诱导肿瘤细胞对化疗和放疗产生耐受性，促进肿瘤细胞的生长、浸润和转移。HlF-1是调节细胞对氧浓度改变的主要因子。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β组成的异二聚体，HIF-1的生理活性主要取决于HIF-1α的活性和表达。HIF-1α可调控超过60种的下游靶基因，参与到能量代谢、血管生成、细胞的增值等生理活动中，其中包括VEGF。细胞氧浓度、肿瘤的遗传基因、细胞因子(如EGF等)可调节HIF-1α的蛋白表达。细胞因子激活相应的酪氨酸激酶受体后，信号可通过P13-K/AKT和ERK/MAPK信号转导通路调节HIF-1α蛋白的合成和功能转化。
EGFR是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，分子量为170kDa，EGFR在多种肿瘤中均有高表达，包括胃癌、结肠癌、头颈癌等，在胃癌中的表达率高达50﹪-74﹪。EGFR与其配体EGF、TGF-a等结合后，可诱导受体二聚体形成，激活多条下游信号传导通路，对肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭及新生血管形成均有促进作用。EGFR的高表达与肿瘤的预后不良、短期复发以及放化疗敏感性降低等直接相关。
Cetuximab(C225)是一种人鼠嵌合的抗EGFR的IgGl单克隆抗体。Cetuximab可阻止受体与相应配体结合，从而抑制下游ERK/MAPK、P13-K/AKT、Jak/Start、蛋白激酶C等信号转导途径。Cetuximab在体内和体外均可抑制血管内皮生长因子(VEGF)的生成，其抑制VEGF生成的机制有可能是通过抑制HlF-1α的表达。同时，Cetuximab与多种化疗药物联合均有协同抗肿瘤作用。Cetuximab已证实在多种肿瘤中有很好的疗效，遗憾的是，到目前为止，Cetuximab联合化疗用于治疗胃癌的临床研究资料非常缺乏。基于以上研究基础，我们假设，Cetuximab在缺氧环境下可提高胃癌细胞对化疗药物Oxaliplatin的敏感性，其机制可能是通过抑制EGFR信号传导，减少HIF-1α的蛋白合成，进而参与抑制VEGF的表达。
2．研究方法
人胃癌细胞株MGC-803，SGC-7901应用不同药物处理后分别培养于正常氧状态和缺氧状态下，采用直接细胞计数法测定细胞生长状况；MTT法测定Cetuximab、Oxaliplatin、以及两药联合的细胞毒作用；采用Annexin V-FITC and Propidium Iodide(P1)双染法通过流式细胞仪检测细胞调亡；提取用不同方法处理后的细胞总蛋白，用免疫印迹的方法分析目的蛋白HIF-1α，P13K/Akt信号通路的关键酶Akt、p-Akt(Ser473)，MEK/MAPK信号通路的关键酶ERK1/2、p-ERK1/2蛋白，以及BAD、p-BAD、BAX的表达情况，应用人抗VEGF单克隆抗体的ELISA试剂盒检测不同方式处理的细胞分泌的VEGF蛋白浓度。
3．研究结果
3．1 缺氧和Cetuximab对胃癌细胞生长的影响
缺氧环境下胃癌细胞的生长速度低于正常氧状态。Cetuximab对胃癌细胞的生长无明显抑制作用。Oxaliplatin可抑制胃癌细胞的生长，且在缺氧状态下，细胞生长受抑制的作用明显低于正常氧状态。两药联合应用后，抑制胃癌细胞生长的作用增强，MGC803细胞常氧状态4gh、72h抑制率分别增加(10±2.0)﹪、(14.2±3.2)﹪，缺氧状态48h、72h抑制率分别增加(24.2±3.0)﹪、(22±4.2)﹪；SGC7901细胞常氧状态48h、72h抑制率分别增加(10.9±1.5)﹪、(7.4±2.8)﹪，缺氧状态48h、72h抑制率分别增加(22.2±4.0)﹪、(19.5±3.6)﹪，说明Cetuximab可加强Oxaliplatin对胃癌细胞生长的抑制作用，且这种协同作用在缺氧环境下表现更为显著。
3．2 缺氧和Cetuximab对胃癌细胞化疗敏感性的影响
正常氧状态下，MGC803和SGC-7901细胞株对Oxaliphtin的IC50分别为5.62±0.10μM和4.11±0.79μM，，而在缺氧环境下，MGCS03和SGC-7901细胞株对Oxaliplatin的IC50分别为19.54±0.13μM和9.75±0.128μM，说明胃癌细胞在缺氧环境下Oxaliplatin敏感性下降。联合Cetuximab后，正常氧状态Oxaliplatin的敏感性分别增加了1.52和1.59倍，缺氧环境敏感性增加了1.73和2.24倍，说明Cctuximab可提高胃癌细胞株MGCS03和SGC．7901的化疗敏感性，且在缺氧环境下，Cetuximab逆转细胞耐药的作用更明显。
3．3 Cetuximab和OxaHplatin在不同氧状态下对胃癌细胞调亡的作用
缺氧本身不增加胃癌细胞的调亡；Cetuximab单独应用不能诱导胃癌细胞MGC803和SGC7901产生凋亡。Oxaliplatin在正常氧态或缺氧状态下都可诱导MGCS03和SGC7901细胞产生凋亡，且调亡产生的比率呈剂量和时间依赖性。缺氧状态下Oxaliplatin诱导细胞产生凋亡的作用明显减弱，而联合Cetuximab可明显增加正常氧状态和缺氧状态下Oxaliplatin诱导细胞凋亡的作用，而缺氧状态下联合治疗增加的细胞凋亡的百分比要明显高于正常氧状态下增加的细胞凋亡百分比。
3．4 Cetuximab对信号通路的作用
Westem blot分析结果示，MGCS03细胞HIF-1α的表达在缺氧状态下明显增加；Cetuximab可下调HIF-1α蛋白的表达水平。Oxliplatin对AKT，ERK1/2和p-AKT，P -ERK1/2蛋白水平没有影响，Cetuximab无论单用或联合Oxaliplatin应用对正常氧状态和缺氧状态培养的MGC803细胞的p-AKT、p-ERK1/2、p-BAD蛋白水平均有下调作用，而对AKT、ERK1/2、BAD和BAX的总量影响不大。与单用Cetuximab相比，Cetuximab联合Oxaliplmin可以进一步降低p-AKT、p-ERK1/2和p-BAD蛋白的表达，尤其在缺氧状态下，几乎完全抑制p-AKT、p-ERK1/2和p-BAD蛋白的表达。
3．5 Cetuximab和缺氧对MGC803和SGC7901细胞VEGF分泌的影响
缺氧环境可诱导细胞VEGF的分泌明显上调。Cetuximab在正常氧态和缺氧状态均可减少细胞分泌VEGF蛋白，缺氧状态下减少VEGF分泌的作用更强。Oxaliplatin对VEGF的分泌也有一定的抑制作用，且呈剂量依赖性。联合Cetuximab与Oxaliplatin作用后，MGC803和SGC7901细胞VEGF蛋白的分泌较单用Cetuximab或Oxaliplatin明显下调，尤以缺氧状态下调更为明显。
4．结论
4.1 缺氧抑制胃癌细胞的增殖和生长，降低胃癌细胞MGCS03和SGC7901对Oxaliplatin的药物敏感性，诱导耐药性的产生，抑制促进细胞凋亡的作用，诱导 HIF-1α的过表达。
4.2 Cetuximab 可提高Oxaliplatin在胃癌胞MGC803 SGC7901中的抗肿瘤活性，逆转缺氧状态下MGC803和SGC7901细胞对Oxaliplatin产生的耐药性。
4.3 Cetuximab逆转缺氧状态下细胞产生的耐药性的分子机制，可能是通过抑制 P13-K/AKT/BAD、ERK/MAPK等的信号转导通路，进一步抑制HIF-1α的表达。
4.4 Cetuximab联合Oxaliplatin可有效的抑制HIF-1α在胃癌细胞MGC830和SGC7901中的表达，并且通过抑制HIF-1α的表达进一步减少胃癌细胞VEGF的分泌。
4.5 HIF-1α介导的血管生成和能量代谢在肿瘤的发生发展过程中有着很重要的作用，Cetuximab能抑制HIF-1α的活性，克服缺氧诱导的耐药性，可能成为胃癌治疗新策略。