真菌和植物因其移动性差,通常易于暴露在极端温度、干旱、盐度和重金属等生物、非生物压力下。热激应答(heat stress response,HSR)是真菌和植物等真核生物进化出的适应这些环境压力的机制之一。热激转录因子(heat shock transcription factors,HSFs)是热激应答中最核心的调控元件,在生物体正常功能维持和对极端胁迫环境的适宜方面发挥重要作用。本实验室在前期研究中筛选出一株耐热毛栓菌异核体菌株Trametes trogii S0301,该菌株具有生长最适温度37℃、生长速度快、高产优良性状漆酶等特性的优势菌株,具有较好的漆酶资源开发应用前景。课题组前期的研究表明该菌株中热激转录因子HSFs可能参与漆酶同工酶的表达调控。为进一步推进该菌株中遗传转化体系等功能基因研究方法的建立及HSF在菌株热耐受性和漆酶表达调控中的作用机制等研究,本研究展开了如下基础性工作:1.耐热T.trogii S0301同核菌株的鉴定及产漆酶能力分析原生质体的制备与再生能从T.trogii S0301菌丝中释放同核体和异核体,经再生后可形成成熟的单菌落。以T.trogii S0301二代基因组数据中交配型B位点基因序列为基础,在相对应基因的边界区设计引物b1和b2位点基因序列,对该段序列进行PCR扩增可在分子水平上验证同核体与异核体。经克隆在多个单菌落中分别扩增到b1型和b2型基因,由此通过原生质体的制备和再生得到了T.trogii S0301同核菌株,本次研究中同核体检出率达到57.8%,并通过PCR验证得到了b1型同核体菌株和b1b2型异核体菌株,但没有得到b2型同核体菌株,由此建立了同核体与异核体鉴定的分子方法。锁状观察是鉴定丝状真菌同核与异核的一种经典佐证方法,在油镜下观察菌丝的锁状结构是一种常用的快速的鉴定同核体的方法。本次研究通过对再生平板进行插片处理,并在油镜下观察再生单菌落菌丝结构发现了部分再生单菌落不存在锁状结构,由此可鉴定为同核体,且该结果与通过PCR鉴定的结果一致。同核体与异核体T.trogii S0301在表型以及产酶特性上存在显著性差异。同核体菌株生长速率较异核体快且菌丝平整,异核体菌株菌丝生长茂密呈绒毛状。在产漆酶方面,在无铜离子诱导的培养基中异核体在前期产酶速率要高于同核体,但在后期产漆酶能力明显减弱且同核体在后期所产漆酶具有较高的酶活。这表明同核体菌株和异核体菌株在漆酶表达调控机制中可能存在差异。2.T.trogii S0301中热激转录因子的克隆及其序列分析前期已证明在T.trogii S0301中存在三个热激转录因子基因:HSF1,HSF2,HSF3。通过设计部分序列引物经PCR扩增得到三个热激转录因子的部分基因序列,经测序比对证实在T.trogii S0301得到了三个热激转录因子HSF1,HSF2和HSF3。对T.trogii S0301在不同的条件下进行热激并提取RNA通过反转录获得三个热激转录因子的全长cDNA序列,其大小分别为:2289 bp,1824 bp,2103 bp。三者分别与其DNA序列相比结果显示,HSF1有3个外显子,两个内含子,内含子长61-73 bp;HSF2有4个外显子,3个内含子,内含子长51-59 bp;HSF3有6个外显子,5个内含子,内含子长51-643 bp。在对三个热激转录因子的测序结果分析中发现HSF2在热激条件下会发生选择性剪接现象并在剪接的过程中生成了HSF2的不同转录本HSF2-1和HSF2-2,其中HSF2-1全长基因包含5个外显子,大小为36-972 bp,4个内含子,大小为51-68 bp。HSF2-2全长基因包含4个外显子,大小为64-972 bp,3个内含子,大小为59-68 bp,HSF2-1与HSF2-2相比缺少一段68 bp的序列,且该段序列具有明显的内含子特征,该段序列的缺失使HSF2-1不能像HSF2-2一样形成一个完整ORF。3.HSF2不同ORF的原核表达及多克隆抗体制备由于T.trogii S0301漆酶的耐高温特性受热激转录因子HSF调控。为了了解其具体调控机制,制备了HSF2的多克隆抗体,为筛选出HSF2的靶点提供基础。通过对HSF2的选择性剪接转录本HSF2-1序列分析发现其存在两个潜在的ORF,ORF1位于N末端,大小约为246 bp,ORF2位于C末端大小约为1077 bp,且这两段ORF序列的氨基酸序列与HSF2完整的ORF氨基酸序列一致,并且其不同功能区域在OR1和ORF2分别保留。对这两段ORF分别设计引物构建原核表达载体并进行诱导结果显示均能表达出融合蛋白。ORF1能表达出大小约为14 kDa的融合蛋白H2-S,ORF2能表达出大小约为42 kDa的融合蛋白H2-L,同时也构建了HSF2非选择性剪接转录本HSF2-2完整ORF3的原核表达载体,ORF3能表达出大小约为62 kDa的融合蛋白H2-Q。通过优化条件对H2-S和H2-L进行表达纯化并免疫小鼠得到了相应的抗血清,western-blot验证结果显示H2-S抗体和H2-L抗体均能特异性识别相应的免疫源蛋白。在不同的条件下对T.trogii S0301及其同核体菌株19#菌进行热激,对热激后的菌株进行总蛋白提取。用H2-L和H2-S抗体通过western-blot对总蛋白样品分别进行检测。结果显示H2-L和H2-S均能识别出总蛋白样品中HSF2全长蛋白,两种抗体标记结果相似,但在识别能力上二者存在明显差异,H2-S的识别能力较H2-L强一些,且western-blot在异核体菌株T.trogii S0301和同核体菌株19#菌显示出相似的结果。对总蛋白进行定量后的western-blot结果显示在同核体菌株19#菌种HSF2的表达量随着热激时间的延长而增加,与在异核体菌株T.trogii S0301的检测结果具有差异。本研究对T.trogii S0301通过原生质体分离成功筛选出了其同核菌株,建立同核体识别的分子生物学方法,能为该菌株中遗传转化体系的建立提供出发材料,发现同核和异核菌株中可能存在不同的漆酶表达调控机制,有待于进一步研究。另外从T.trogii S0301中克隆获得了该菌株中3个HSF,并发现了HSF2选择性剪接现象的存在,HSF2抗体的制备为在该菌株中进行HSF2结合靶基因的筛选、HSF对漆酶表达的调控等功能研究奠定了基础。