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背景和目的:骨肉瘤是儿童和青少年中一种非常普遍的原发恶性骨瘤,其特点为具有破坏周围组织并几乎专一地向肺转移的高度恶化的倾向,这些是其引起死亡的主要原因。在年轻的病人中,它主要定位于股骨远端和股骨近端区域。尽管骨肉瘤已经面对新辅助化学疗法和手术的联合治疗超过30年,再发或者转移的骨肉瘤患者仍然存在极差的预后,伴随着不到10%的长期生存。到目前为止,骨肉瘤的发生,发展和转移的潜在的分子机制仍不完全为人们所知。因此,鉴定针对骨肉瘤的新的治疗靶位和发展治疗策略仍是非常必要的。miRNAs作为一组小非编码单链的RNA片段,其长度大小为18-25个核苷酸,这类非编码RNA在肿瘤形成和癌症进展中发挥关键的调控作用。近期的研究表明,这些miRNAs可以通过与其靶基因的m RNA的3’-UTR或者编码区不完全的碱基互补配对来抑制其翻译成蛋白质或者直接降解其m RNA片段。这些数据表明,miRNAs可以用来作为诊断生物标志物并发挥其致癌基因或者抑癌基因的功能作用,其致癌性或抑癌性是基于其靶向的m RNAs的功能决定的。据报道,许多miRNAs,例如miR-29,miR-125b,miR-143,miR-199a-3p等等,可以参与骨肉瘤(OS)的肿瘤生长、进展和转移等过程。先前的研究表明,恶性转移的支气管上皮细胞中miR-506的恢复可以抑制细胞的增殖作用。miR-506的过表达可以抑制上皮-间叶细胞的转变并抑制人乳腺癌细胞的粘附,入侵和迁移。而且,miR-506在建立的羟基喜树碱耐受的结肠癌细胞中的过表达可以通过抑制过氧化物酶体活化的受体α(PPARα)的表达发挥对羟基喜树碱的耐受作用。虽然近年来miR-506已经得到了广泛的研究,然而它在骨肉瘤(OS)发起和进展中的作用以及其发挥功能作用的分子机制仍知之甚少。本课题包括以下三部分:第一部分:AEG-1和miR-506在骨肉瘤(OS)中的功能研究;第二部分:miR-506通过靶向抑制AEG-1发挥对骨肉瘤(OS)的功能作用;第三部分:miR-506、AEG-1通过调节Wnt/β-catenin信号通路发挥其对骨肉瘤(OS)的抑制作用。第一部分AEG-1和miR-506在骨肉瘤(OS)中的功能研究方法:1.通过western blot和real-time PCR的方法分别检测了AEG-1和miR-506在骨肉瘤(OS)组织和细胞系MG63中的表达水平。2.通过MTT实验检测AEG-1的敲低或miR-506过表达对骨肉瘤(OS)细胞系MG63细胞活性的影响。3.通过流式细胞术的方法检测AEG-1的敲低或miR-506过表达对骨肉瘤(OS)细胞系MG63的细胞凋亡的影响。4.通过构建骨肉瘤(OS)的小鼠模型,在体内实验中验证miR-506对骨肉瘤(OS)的功能作用。结果:1.骨肉瘤(OS)中miR-506的表达水平与AEG-1的蛋白表达水平呈现负相关。2.AEG-1的敲低或miR-506的表达上调可以抑制骨肉瘤(OS)细胞系MG63的增殖。3.AEG-1的敲低或miR-506的表达上调可以促进骨肉瘤(OS)细胞系MG63的凋亡活性。4.miR-506的过表达可以抑制体内实验中骨肉瘤(OS)的细胞生长。第二部分miR-506通过靶向抑制AEG-1发挥对骨肉瘤(OS)的功能作用方法:1.通过生物信息学分析推测miR-506的靶基因。2.构建野生和突变型的AEG-1 3’-UTR的重组质粒,通过双荧光素酶报告实验验证miR-506的靶基因。3.通过western blot和real-time PCR的方法检测miR-506过表达和敲低后AEG-1的表达。结果:1.生物信息学预测显示AEG-1为miR-506的靶位基因。2.双荧光报告基因实验验证AEG-1为miR-506的靶位基因。3.miR-506的过表达可以抑制骨肉瘤(OS)细胞系MG63中AEG-1的表达。第三部分miR-506、AEG-1通过调节Wnt/β-catenin信号通路发挥其对骨肉瘤(OS)的抑制作用方法:1.通过western blot和real-time PCR的方法检测miR-506过表达或AEG-1的敲低对β-catenin,c-myc和cyclin D1的表达水平的影响。2.通过流式细胞术的方法检测si-β-catenin造成的Wnt/β-catenin信号通路的抑制对骨肉瘤(OS)细胞系MG63细胞凋亡的影响。3.通过流式细胞术的方法检测Wnt/β-catenin信号通路的小分子抑制CGP049090对骨肉瘤(OS)细胞系MG63功能的影响。结果:1.miR-506的表达上调和AEG-1的表达下调可以明显降低骨肉瘤(OS)细胞系MG63中β-catenin,c-myc和cyclin D1的表达水平。2.si-β-catenin造成的Wnt/β-catenin信号通路的阻断可以抑制骨肉瘤(OS)细胞系MG63的细胞增殖并诱导其细胞凋亡。3.Wnt/β-catenin信号通路的小分子抑制CGP049090可以抑制骨肉瘤(OS)细胞系MG63的细胞增殖并诱导其细胞凋亡。结论:1.骨肉瘤(OS)中miR-506的表达水平与AEG-1的蛋白表达水平呈现负相关。2.miR-506的表达上调可以抑制骨肉瘤(OS)细胞系的增殖。3.miR-506的表达上调可以促进骨肉瘤(OS)细胞系的凋亡活性。4.AEG-1为miR-506的直接靶位基因。5.miR-506可以抑制体内实验中骨肉瘤细胞的生长。6.miR-506、AEG-1通过调节Wnt/β-catenin信号通路发挥其对骨肉瘤(OS)的抑制作用。