研究背景骨骼肌约占人体重量的40%左右,健康的肌肉状态不仅是运动的必要条件,也是人们提高生活质量的保障。运动负荷可以维持肌肉处于良好状态,而制动会导致运动负荷丧失或减少,从而引起肌肉生理、生化及生物力学等的改变。受制动影响最大的肌肉包括比目鱼肌、腓肠肌、股外侧肌等。制动引起的废用性肌萎缩表现为肌纤维体积减少、肌重量降低、肌细胞大量凋亡、肌纤维缩短。这样的萎缩多发生于骨或中枢神经系统损伤、慢性病,或其他神经系统疾病以后等。PI3K/Akt/mTOR通路是蛋白质合成的关键通路,制动后肌肉状态的恢复取决于与蛋白质合成相关的代谢改变是否维持在正氮平衡状态。Akt的磷酸化能促进肌肉肥大而抑制肌肉萎缩。同时,研究发现抑制肌细胞的凋亡能有效减缓制动引起的肌萎缩及纤维化过程。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)家族的重要成员,作用分别为抑制细胞凋亡和促进细胞凋亡,它们被认为是细胞凋亡的核心调控因子。研究发现,骨骼肌萎缩后大量肌细胞凋亡并伴随着凋亡易感基因Bcl-2和Bax表达的变化,结果显示Bcl-2和Bax蛋白参与了肌萎缩的全过程。肌纤维细胞属于成肌分化的最后产物,而一旦肌纤维损伤,机体的自我修复过程需要少量位于肌膜和肌纤维基底膜之间的肌卫星细胞参与。肌纤维损伤后,卫星细胞被激活,分裂增生后形成新的肌纤维或修复现有的纤维。长期制动能引起肌肉的废用性萎缩,肌卫星细胞在此过程中相应减少,这可能是与肌卫星细胞增殖过程被破坏有关。此前普遍认为肌肉损伤或萎缩后,肌卫星细胞是最佳的移植细胞。可是,研究发现机体内肌卫星细胞对肌纤维的修复或重建的影响极其有限。首先,肌卫星细胞随着年龄的增长逐渐减少,它的修复潜能是有限的。严重的肌营养不良,长期的修复过程耗尽了肌卫星细胞,在此过程中肌纤维逐渐被结缔组织所替代。其次,肌卫星细胞移植后会出现迁移受限及凋亡问题,这极大限制了肌肉修复及重建的有效性。另外,研究发现体外培养、增殖肌卫星细胞会导致其重建肌肉能力的丧失。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,MSCs)具有多向分化潜能,能促进骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪等间充质组织的再生。MSCs具有易获得、易培养、分化、增殖等优点,越来越受再生医学的青睐。有文献报道,在心脏毒素所导致的肌损伤模型中,MSCs能保护肌卫星细胞的功能。同时大鼠骨骼肌缺血性损伤模型也证实MSCs能有效减少受损肌细胞的进一步凋亡,但MSCs对制动所引起的废用性肌萎缩中肌卫星细胞增殖和肌细胞凋亡影响的研究还未见报道,仍需要深入研究。研究目的(1)明确MSCs对制动大鼠骨骼肌中肌卫星细胞增殖的影响,(2)明确MSCs对制动大鼠骨骼肌细胞凋亡的影响。(3)明确MSCs对大鼠制动后骨骼肌中Akt磷酸化水平的影响研究方法l.MSCs的原代分离培养及纯化选取5只6～8周幼龄大鼠麻醉后,无菌条件下取出股骨和胫骨剪掉股骨和胫骨的骨骺端,露出骨髓腔,用添加100u/mL青、链霉素的α-DMEM培养基冲出骨髓,反复吹打将冲出的骨髓制成单细胞悬液,离心弃上清,接种于培养瓶中。2天后进行首次换液,清除非贴壁细胞,以后每3天全量更换新鲜培养基。1:3的比例进行传代培养。实验选取3-5代MSCs使用。2.MSCs鉴定通过流式细胞仪检测细胞表面标记,鉴定所取细胞。具体过程如下:细胞传至4代时,选取生长状态良好细胞,0.25%胰酶消化,4℃离心,1200 r/min,5min,用PBS清洗细胞3次,各管依次加入单克隆抗体CD34、CD44、CD45、CD90。同时每管样品设立未加抗体的阴性对照。避光冰上孵30min,用PBS洗涤细胞3次,以除去未结合抗体,用500 μLPBS重悬细胞,通过流式细胞仪进行检测分析。3.慢病毒转染自身失活慢病毒表达增强型绿色荧光蛋白(GFP)基因的β控制下的巨细胞病毒(CMV)肌动蛋白/β 珠蛋白基因内含子的杂合启动子(LV-GFP)应用(19)。MSCs以5× 104个/孔的密度接种在六孔板上,在37℃的环境下培养24h,感染复数(MOI)为50。后除去含病毒的培养基,将MSCs培养在标准培养基上48小时。含GFP标记的MSCs通过流式细胞仪分选。4.动物实验分组及模型制备根据随机数字分组法将48只大鼠分成WB(weight bearig)组,IM-MSCs(immobilized and MSCs received)组,IM-PBS(immobilized and PBS received)组。IM-MSCs和IM-PBS组大鼠右F肢采用石膏固定法制动14天,WB组未制动,下肢捆绑同重量石膏,但未限制关节活动,1M天后各组大鼠解除右后肢石膏固定,取标本分析。模型制备过程如下:大鼠行8%水合氯醛腹腔内注射麻醉后,在其右侧后肢的踝关节及腹股沟等血管容易受压处衬一层薄厚适宜的棉垫,为保证负重等量可塑性石膏,将石膏绷带裁剪成1.5cm宽,20-25cm长,固定大鼠右下肢:足趾屈120°,膝关节伸直[10],使比且鱼肌处于缩短位。5.骨髓间充质干细胞移植造模成功后24小时,IM-MSCs组及IM-PBS组所有大鼠麻醉后去除可塑性石膏。IM-MSCs组大鼠比目鱼肌局部多点注射LV-GFP-MSCs;WB组和IM-PBS组大鼠比目鱼肌注射等量PBS。具体操作过程如下:消化已经准备好的4代骨髓间充质干细胞,并计数,将每1×106个骨髓间充质干细胞重悬于50 ul无菌生理盐水中,IM-MSCs组大鼠右侧比目鱼肌肌腹多点注射50 ul间充质干细胞悬液,WB组和IM-PBS组大鼠于相同位置注入等体积的PBS。注射完成后再次可塑性石膏制动,2周后去除可塑性石膏,取材分析。6.肌肉组织学及肌肉力量检测各组大鼠固定14天,8%水合氯醛行腹腔内注射麻醉后,仔细解剖出比目鱼肌,用不可吸收的手术线将两端绑牢。将肌肉放入22℃-24℃的林格氏液中,使肌肉处于松弛状态,一端以手术线固定在实验架上,并将电极深埋在结扎附着点附近,另外一端以手术线为牵引,连接于肌肉张力换能器的传感器上,并连接计算机。调节强直刺激电流强度100Hz,时间400ms,采集数据并分析。其余肌肉组织用常规甲醛固定后经过夜脱水,横向切成约3 um厚的组织切片。切片行HE染色切片后在光学显微镜下进行评估,并用数码相机拍摄的照片。7.Bromodeoxyuridine(Brdu)的标记与测量24h后各组大鼠连续腹腔注射BrdU(0.8 mg/ml)3天,14d后取比目鱼肌分析。样品洗净后切片,与小鼠抗BrdU单克隆抗体孵育(1:200,sigma,美国)和Pax7抗体(1:200,Abcam)4℃过夜。随后孵育 Alexa 594 山羊抗小鼠 IgG(1:500,Abcam)和Alexa 488羊抗兔IgG(1:500、Abcam)二抗。滴适量DAPI于标本上用于染核,放置lmin。被FITC标记的小鼠抗BrdU单克隆抗体显示绿色荧光,而Pax7抗体显示红光。后放置在荧光显微镜下数取Pax7/BrdU阳性细胞的数量。技术方法:通过Image-pro plus 5.0软件及其配套的系统完成图像采集及计数,每组大鼠取25张切片计数,从而得出Pax7/BrdU阳性细胞平均数量。8..脱氧核苷末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法检测肌细胞凋亡肌细胞的凋亡采用TUNEL法检测,试剂盒来自美国Roche公司,实验步骤遵循说明书:肌肉组织切成6微米厚度的切片(已被多聚赖氨酸处理)20分钟,后在TUNEL反应混合物中避光孵育60分钟,温度37℃。DAPI染核,在显微镜下观察观察阳性细胞数,Image J软件分析。9.蛋白质印迹(Western Blotting,WB)肌肉匀浆混合在溶解缓冲液和蛋白酶抑制剂中,煮沸,经SDS-PAGE电泳,转至 PVDF 膜上,5%奶粉封闭,Phospho-AktSer473(1:1,000,#9271,Cell Signaling Technology,Danvers,MA,USA),Akt(1:1,000,#9272 Cell Signaling Technology),Bcl-2(1:1,000,G9545,Sigma-Aldrich),Bax(1:1,000,B3428,Sigma-Aldrich)等一抗4℃孵育过夜,相对应的二抗孵育,生物成像系统成像,条带通过Image J软件分析。10.统计分析数据采用GraphPadPrism软件分析处理。实验结果以x±s表示。采用t检验和单因素方差分析(ANOVA)进行统计学比较。所有数据均以均数±标准差表示。统检验水准α=0.05,P<0.05为差异有显著性意义,P<0.01为差异有非常显著性意义。研究结果1.MSCs培养、扩增和鉴定原代培养24 h后有少量细胞贴壁,漂浮细胞较多,大多为血细胞。2d后首次换液,可见散在的贴壁细胞,呈短梭形、椭圆形、三角形等。以后每隔3 d换液。3～7d后贴壁细胞增多,逐渐伸展呈多角形、长梭形。随着培养、换液的进行,血细胞等非贴壁细胞基本去除,细胞形成集落单位。7～12 d细胞铺满瓶底80%～90%。以1:3传代,以后5～6 d传代1次。流式细胞仪检测第4代BMSCs表面标记,CD44,CD90表达阳性,CD34,CD45表达近乎阴性,CD44和CD90的阳性率分别为93.83%,96.88%;而 CD34 和 CD45 的阳性率分别为 6.32%,8.32%。2.肌肉湿重、肌横截面积、最大肌收缩力结果14d后各组大鼠体重比较,无明显统计学意义。大鼠麻醉后获取比目鱼肌标本,比较肌肉湿重、肌横截面积、最大肌收缩力等指标。与WB组比较,IM-MSCs组,IM-PBS组比目鱼肌横截面积、最大肌收缩力、湿重、肌湿重/体重数值明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。但IM-MSCs、IM-PBS组间比较,差异无明显的统计学意义(P<0.05)。3.MSCs促进肌卫星细胞增殖Pax7通常作为肌卫星细胞的特异性标志物,而BrdU标记法可以显示新生增殖细胞。我们通过荧光染色双标Pax7阳性细胞核及BrdU阳性细胞,测定肌卫星细胞的增殖情况。结果显示大鼠下肢制动14d后,与WB组比较,IM-PBS组中Pax7+、Pax7+/BrdU+细胞下降明显,而IM-MSCs组中Pax7+、Pax7+/BrdU+细胞明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。为有效的比较各组肌卫星细胞的增殖情况,我们还比较了 Pax7+/BrdU+双阳性细胞占Pax7+阳性细胞比值。与IM-PBS组比较,WB组、IM-MSCs组中Pax7+/BrdU+双阳性细胞占Pax7+细胞比率明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。表明MSCs不仅阻止了肌卫星细胞数量的下降,也引起明显的卫星细胞增殖。4.MSCs抑制肌细胞凋亡TUNEL检测法又称DNA断裂的原位末端标记法,是一种常用的检测细胞凋亡的方法。实验中,绿色荧光代表断裂或凋亡的DNA,蓝色荧光代表细胞核,我们每组标本随机选取1000个肌细胞,计算其中荧光双标染色数目。与WB组比较,IM-PBS组、IM-MSCs组荧光双标染色数目明显增加,显示肌细胞凋亡数量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。而IM-PBS组、IM-MSCs组相比较,IM-MSCs组荧光双标染色数目明显少于PBS组,差异有统计学意义(P<0.05)。5.MSCs提高Akt磷酸化水平,调控了 Bax、Bcl-2蛋白表达抗凋亡蛋白Bcl-2的表达:与WB组比较,IM-MSCs组和IM-PBS组比目鱼肌中Bcl-2蛋白表达量明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与IM-PBS组比较,IM-MSCs组比目鱼肌中Bcl-2蛋白表达量显著增高,差异有明显统计学意义(P<0.05)。凋亡蛋白Bax的表达:与WB组比较,IM-MSCs组和IM-PBS组比目鱼肌中Bax蛋白表达量明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),与IM-PBS组比较,IM-MSCs组中Bax蛋白的表达明显降低,差异有明显统计学意义(P<0.05)。p-Akt/t-Akt比值结果:与WB组比较,IM-MSCs组和IM-PBS组比目鱼肌中蛋白p-Akt/t-Akt比值明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与IM-PBS组比较,IM-MSCs组比目鱼肌中p-Akt/t-Akt比值显著增高,差异有明显统计学意义(P<0.05)。结论在制动所导致废用性肌萎缩模型中,局部注射骨髓间充质干细胞可促进肌卫星细胞的增殖,抑制肌细胞凋亡。