论文部分内容阅读
目的:双相磷酸钙（biphasic calcium phosphate,BCP）作为一种具有生物活性的骨替代材料,目前已广泛应用于临床,然而其在骨组织工程应用中仍有力学性能较差、骨诱导活性不足等缺点,一定程度上影响了骨缺损处的再生和修复。本实验拟以多孔BCP为陶瓷基体,制备出具有微米孔隙结构的晶须增强型BCP（whiskers reinforced BCP,BCPw）和具有微纳米孔隙结构的纳米颗粒（nanoparticles,NPs）复合晶须增强型BCP（BCPw-NPs）两种新型BCP多孔陶瓷,期望改性后的新型多孔陶瓷具有更丰富的微纳米孔隙结构,通过考察具有不同微纳结构的材料对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）生长、增殖以及骨向分化能力的影响和作用,评价其体外生物学效应。方法:（1）BCPw和BCPw-NPs陶瓷材料的制备和表征:以BCP为陶瓷基体,通过一系列改性实验处理,分别制备出BCPw和BCPw-NPs陶瓷材料,使用扫描电子显微镜（Scanning electron microscope,SEM）、X-射线衍射仪（X-ray diffractometer,XRD）、比表面仪、阿基米德排水法等表征BCP、BCPw、BCPw-NPs的微纳米结构、相组成、孔隙率与吸水率以及比表面积。（2）兔BMSCs的分离培养与鉴定:无菌环境下分离出新生新西兰兔的股骨、胫骨、肱骨骨髓腔内的原代细胞并培养,综合使用光学显微镜、CCK8实验、免疫荧光染色实验和定向诱导分化实验鉴定细胞的形态特征、增殖能力、表型以及多向分化能力。（3）材料对BMSCs的骨向分化诱导作用研究:将BMSCs分别接种在BCP、BCPw、BCPw-NPs陶瓷材料上进行共培养,以细胞培养板为对照组,在特定时间点分别对各组进行二乙酸荧光素（fluorescein diacetate,FDA）/碘化丙啶（propidiumiodide,PI）染色实验、CCK8实验、实时荧光定量聚合酶链式反应（quantificative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）实验,检测BMSCs在不同陶瓷材料上的存活、增殖和分化情况,对不同材料的细胞生物学效应进行评价。结果:（1）材料的制备和表征:SEM结果显示,BCP、BCPw、BCPw-NPs三种材料均呈蜂窝样多孔结构,大孔和小孔散在分布,其大孔尺寸在100～500μm范围之间,部分大孔内还有孔径尺寸在10～100μm的贯通孔,表明孔隙贯通性良好;BCPw表面有大小均一、分布均匀且密集、直立径向生长的六边形柱状体（HA晶须）;BCPw-NPs表面由HA晶须和在晶须间及晶须顶部填充和覆盖的粒径小于100 nm的纳米颗粒所组成。XRD结果表明,BCP、BCPw、BCPw-NPs三种多孔陶瓷的表面均由HA相和β-TCP相组成,无其他杂相。BCP、BCPw、BCPw-NPs三种多孔陶瓷的孔隙率分别为74.8±1.55%、66.83±3.42%、83.05±1.06%,吸水率分别为22.16±1.77%、32.38±1.09%、38.54±2.18%。BCP、BCPw、BCPw-NPs三种多孔陶瓷的比表面积分别为1.24 m~2/g、1.45 m~2/g,1.93 m~2/g。（2）新生新西兰兔BMSCs的分离培养和鉴定:从兔体内分离提取的细胞在光学显微镜下呈长梭形,漩涡状贴壁生长;CCK8实验结果表明所培养细胞具有较好的增殖能力;免疫荧光染色结果为细胞表达间充质干细胞表型CD44,不表达造血干细胞表型CD45;成骨细胞诱导分化28 d后进行茜素红S染色,观察到深红色、大小不一的块状钙结节;成脂细胞诱导分化28 d后进行油红O染色,观察到细胞内出现橘红色、大小不一的圆形脂滴;成软骨细胞诱导分化28 d后进行甲苯胺蓝染色,观察到细胞质被染成蓝紫色,结果表明分离培养的细胞为BMSCs,且具有多向分化潜能。（3）材料对BMSCs的骨向分化诱导作用研究:在细胞增殖实验中,培养前期阶段材料组细胞增殖较缓慢,组间无明显差异（P＞0.05）,在培养14 d后,对照组细胞进入增殖平台期,材料组细胞迅速增殖,到最后组间无明显差异（P＞0.05）。FDA/PI染色实验结果与细胞增殖实验结果一致。骨向分化实验中,三个材料组的成软骨相关基因（Sox9、ColⅡ、MMP13）和ColⅠ的表达水平均低于对照组并呈逐渐降低的趋势,ColⅩ在BCPw-NPs组的表达水平显著高于其他组;三个材料组的成骨相关基因（Runx2、Osterix、BMP2、OPN、OCN）表达水平均高于对照组,在BCPw-NPs组的增高趋势较显著并且能有效维持高表达。结论:本实验以普通BCP为陶瓷基体,设计并制备了具有微晶须表面结构的BCPw和具有微纳米孔隙表面结构的BCPw-NPs。将三种具有不同微纳米表面结构的材料与BMSCs共培养后,具有微纳米孔隙表面结构的BCPw-NPs表现出了较强的诱导BMSCs向成骨细胞分化的能力。