【摘 要】
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牛结核病（Bovine Tuberculosis）是潜伏期长、感染率高、发病慢、治愈难和疫苗缺少的人畜共患传染病。“检疫和扑杀”患病和带菌牛成为目前牛结核病防控手段,因此,开发一种准确、快速、廉价、易操作的牛结核病诊断方法是国内外控制牛结核病的技术需求。目前牛结核病检疫方法为依赖结核菌素（PPD）皮内变态反应,但由于PPD成分复杂,并不能区分致病性结核分枝杆菌、其他分枝杆菌和卡介苗免疫反应,所以检
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牛结核病（Bovine Tuberculosis）是潜伏期长、感染率高、发病慢、治愈难和疫苗缺少的人畜共患传染病。“检疫和扑杀”患病和带菌牛成为目前牛结核病防控手段,因此,开发一种准确、快速、廉价、易操作的牛结核病诊断方法是国内外控制牛结核病的技术需求。目前牛结核病检疫方法为依赖结核菌素（PPD）皮内变态反应,但由于PPD成分复杂,并不能区分致病性结核分枝杆菌、其他分枝杆菌和卡介苗免疫反应,所以检测结果容易出现假阳性,从而引发更多的人畜感染。目前的研究现状主要是通过筛选牛结核分枝杆菌特异性抗原,其中包括单个的ESAT6和CFP10,通过免疫优化检测结果。研究问题是如何解决ESAT6和CFP10抗原刺激机体产生的免疫反应较低和检测灵敏度降低所致的假阴性?假设认为将ESAT6和CFP10这两种蛋白通过重组重叠技术设计成重组重叠肽（ROP-TB）作为牛结核皮试诊断抗原,就会有更多的的抗原位点暴露出来,增加检测的准确性。为了验证假设,本研究通过ROP-TB质粒构建、大肠杆菌原核表达纯化及鉴定、ROP-TB体外Cathepsin S酶切和ROP-TB抗原提呈、小鼠体内攻毒试验、豚鼠皮试试验和牛皮试试验进行系统研究。结果显示,将牛结核分枝杆菌早期分泌的特异性蛋白ESAT6和CFP10,人工组合成重组重叠肽（ROP-TB）,经原核表达和纯化,制备出纯度为100%的ROP-TB;体外试验发现,ROP-TB可以被DC细胞溶酶体酶Cathepsin S切开,同时,相比与野生型蛋白ESAT6和CFP10抗原,ROP-TB抗原把更多的表位呈递给T细胞,刺激机体产生更强的免疫反应;体内小鼠结核模型接种ROP-TB试验结果显示,ROP-TB可以刺激结核小鼠脾脏T细胞释放IFN-γ;豚鼠皮试试验结果显示,与ESAT6/CFP10和结核菌素（PPD）相比较,ROP-TB产生更强的皮肤反应（P＜0.01）;牛皮试试验结果显示,健康牛（n=40）中,PPD以及ROP-TB检测均为阴性,疑似结核牛（n=12）中,PPD检测出7头阳性,5头阴性;ROP-TB检测出7头阳性,5头阴性;如果以PPD作为标准,ROP-TB检测灵敏度为85.7%,检测特异性为97.7%。由此得出结论,基于牛结核菌特异性蛋白ESAT6和CFP10,经过蛋白重组并且重叠设计制作的ROP-TB,产生良好反应,其中包括把更多的抗原表位呈递给T细胞引起更强的免疫反应、刺激动物脾脏产生IFN-γ、刺激动物皮肤出现更强的反应。从而证明ROP-TB是一种优化的牛结核皮试诊断试剂,在提高特异性的同时,还具有一定的灵敏度,具有潜在的应用前景。
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