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AAVS1位点是位于人类基因PPP1R12C第一个内含子上的一段特定序列,在该位点中敲入外源基因片段具有稳定表达、不影响其他基因转录的优点。近几年来,出现一种新的基因编辑的技术CRISPR/Cas9,该技术进行基因编辑时需要在细胞内表达一个160kd的Cas9蛋白和很小片段sgRNA,目前主要通过瞬时表达载体在细胞内表达Cas9蛋白和sgRNA,由于在一些细胞中导入钱体效率不高而影响切割效率,而如果在人细胞的AAVS1位点插入一个可诱导型表达Cas9蛋白的表达盒,通过诱导,可在细胞内先表达Cas9蛋白,再通过转染的方式导入小片段的sgRNA即能大大提高切割效率,并且可同时导入多个sgRNA进行多基因的同时编辑。并且可诱导的Cas9蛋白的表达也避免了持续表达的Cas9蛋白在细胞内长期表达,对细胞有毒性,容易造成实验误差的影响。本课题拟尝试利用CR1SPR/Cas9技术在人细胞的AAVS1位点中插入可诱导型Cas9的表达盒。首先,本实验针对在AAVS1位构建了质粒LentiCRISPRv2-sgRNA1/2/3,检测其切割效率分别为22%、25%和27%,并检测发现LentiCRISPRv2-sgRNA2/3在其潜在脱靶位点上不存在脱靶效应。其次,利用LentiCRISPRv2-sgRNA2/3质粒和AAV-CAGGS-EGFP donor质粒进行了HEK293T和人牙胚间充质永生化细胞的AAVS1位点的敲入外源基因EGFP的实验。结果表明LentiCRISPRv2-sgRNA2/3质粒与AAV-CAGGS-EGFP doner质粒可以实现在这两种细胞的AAVS1位点中插入EGFP表达元件,并且插入效率差异不大。最后,利用LentiCRISPRv2-sgRNA2/3质粒以及可诱导型Cas9的表达盒的组件：Puro-Cas9 donor和Neo-M2rtTA donor质粒进行了HEK293T细胞的AAVS1位点上插入可诱导型Cas9表达盒的实验。蛋白质印记的结果显示可以在人的细胞中插入可诱导型Cas9表达盒。