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氟是与人体健康密切相关的微量元素之一,适量摄入有益于机体的生长发育及维持骨骼、牙齿的正常结构和生理机能;一旦被过量摄入,就会通过血液循环进入全身各处,并在体内蓄积,引起机体急性或慢性氟中毒效应,称为地方性氟中毒,简称地氟病。地氟病致病机制复杂,涉及氧化应激、线粒体改变、内质网应激、信号转导通路改变等。研究表明,氟暴露致细胞凋亡异常可能也是氟致细胞损伤的机制之一。细胞凋亡是一种由基因调控的程序性死亡,真核细胞主要通过内部线粒体途径、内质网途径和外部死亡受体途径介导细胞凋亡发生。我们前期的研究提示,内质网和线粒体途径参与了氟暴露致细胞凋亡异常,但氟暴露致细胞凋亡的死亡受体途径鲜见报道,Fas/Fas L信号通路是主要死亡受体通路之一,在细胞凋亡过程中起重要作用。且在许多细胞凋亡进程中,常伴随Ca2+浓度异常增加,特别是在凋亡早期,细胞内Ca2+浓度异常升高,提示Ca2+可能是启动细胞凋亡的早期信号之一。而在对氟中毒动物模型和体外细胞毒性试验中均检测到细胞内钙离子超载的现象,并证实其与活性氧水平升高以及细胞凋亡密切相关。前期在体动物神经电生理研究表明,细胞内钙超载可能是氟暴露后细胞膜上L-型钙通道活性改变导致的。L-型钙通道拮抗剂是Ca2+进入细胞的阻滞剂,可以有效减少细胞内的Ca2+浓度,抑制凋亡起始信号。但L-型钙通道拮抗剂是否对氟化物诱导的Fas/FasL信号通路依赖性凋亡具有干预作用及其保护机制的研究鲜有报道。本研究通过体外试验探讨Fas/FasL信号通路在氟诱导PC12细胞凋亡中的作用及分子机制,并探究L-型钙通道拮抗剂Nifedipine在上述过程中的干预效果。1.Fas/FasL凋亡途径在氟致PC12细胞损伤中的作用为探讨Fas/FasL信号通路在氟致PC12细胞凋亡中的作用及分子机制,实验采用含20、40、80、160 mg/L NaF培养液处理PC12细胞12、24、36、48小时后,检测细胞活性;用上述不同剂量梯度NaF培养液处理PC12细胞24小时后,检测细胞内活性氧水平、细胞凋亡率、细胞内Fas/FasL信号转导通路Fas、FasL、FADD、Caspase 8、Caspase 3和Bid基因/蛋白表达水平。实验结果如下:(1)细胞活性检测结果:氟暴露12、24、36 h后,各剂量组细胞存活率均呈下降趋势,且呈氟暴露剂量依赖性,其中在160F氟暴露时,PC12细胞存活率均呈极显著下降(P<0.01);自染氟24 h后开始,80F组PC12细胞存活率呈极显著下降(P<0.01),染氟48 h后,各氟暴露组细胞剂量-存活率曲线经历了先极显著升高(P<0.01),然后再极显著下降(P<0.01)的过程。(2)细胞内活性氧水平检测结果:不同剂量氟暴露24 h后,与对照组比,40F组PC12细胞活性氧水平显著增加(P<0.05),80F与160F组PC12细胞活性氧水平呈极显著增加(P<0.01),且各组PC12细胞活性氧水平呈氟暴露剂量依赖性。(3)细胞凋亡率检测结果:各剂量氟暴露组早期和晚期凋亡细胞数目较对照组均极显著增加(P<0.01),氟化钠剂量越高,细胞凋亡率(早、晚期细胞凋亡率之和)越高,且晚期凋亡细胞数目所占比例也逐渐增加。(4)Fas/FasL信号通路相关分子基因/蛋白表达结果:PC12细胞不同剂量氟暴露24 h后,与对照组比,随氟暴露剂量的增加,Fas、FasL、FADD、Caspase 8、Caspase 3基因和蛋白表达水平均呈上升趋势(P<0.05),且与氟暴露剂量呈依赖性;而各氟暴露剂量组Bid基因和蛋白表达水平逐渐下降,其中80F和160F组呈显著或极显著下降(P<0.05或P<0.01)。综上所述,氟暴露引起PC12细胞内活性氧水平升高,导致Fas/FasL信号通路中各分子表达水平显著上升(P<0.05),Bid表达水平显著下降(P<0.05),诱导细胞异常凋亡,最终影响细胞活性,且以上指标均呈氟暴露剂量依赖性。结果提示Fas/FasL信号通路在氟暴露致PC12细胞凋亡中起重要作用,其中FADD可能是Fas/FasL信号通路中的重要靶分子。2.L-型钙通道拮抗剂对氟诱导的PC12细胞凋亡的影响为探讨L-型钙通道拮抗剂Nifedipine对氟诱导PC12细胞通过Fas/FasL信号通路凋亡的干预效果,实验采用剂量效应明显的80 mg/L NaF分别与0.5、1.0、2.0、4.0μM的L-型钙通道拮抗剂Nifedipine联合处理PC12细胞24 h后,检测PC12细胞内活性氧和钙离子水平、细胞凋亡率、细胞膜L-型钙通道Cav1.2及Fas/FasL信号通路相关基因/蛋白表达水平、细胞周期分布情况。实验结果如下:(1)细胞内活性氧水平检测结果:与对照组比,F组与F+4.0N组细胞内活性氧水平极显著上升(P<0.01)。与F组比,F+0.5N组、F+1.0N组、F+2.0N组与F+4.0N组活性氧水平均极显著下降(P<0.01)。不同剂量Nifedipine处理组活性氧水平呈现先降低后升高的趋势。(2)细胞内钙离子水平检测结果:各处理组细胞内钙离子水平较对照组显著升高(P<0.05);与F组比,F+1.0N组与F+2.0N组细胞内钙离子浓度极显著降低(P<0.01),F+0.5N组和F+4.0N组虽无显著性差异,但有下降的趋势。(3)细胞凋亡率检测结果:与对照组比,各处理组早期和晚期凋亡细胞数目均极显著增加(P<0.01);与F组比,F+0.5N组、F+1.0N组和F+2.0N组凋亡细胞数目呈Nifedipine剂量依赖性减少(P<0.01),而F+4.0N组凋亡细胞数目出现上升趋势。晚期凋亡细胞比例先减少而后增加。(4)基因/蛋白表达结果:与对照组比,F组与F+0.5N组Cav1.2和Fas/FasL信号通路相关基因/蛋白表达水平显著升高(P<0.05)或有升高趋势,各处理组Bid基因和蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与F组比,F+1.0N组和F+2.0N组Cav1.2以及上述Fas/FasL信号通路相关基因/蛋白表达水平显著降低(P<0.05),F+2.0N组Bid基因和蛋白表达水平极显著升高(P<0.01)。(5)细胞周期检测结果:与对照组比,F组与F+4.0N组G1期细胞数量极显著增加(P<0.01),S期细胞极显著减少(P<0.01);与F组比,F+0.5N组、F+1.0N组和F+2.0N组G1期细胞极显著减少(P<0.01),S期细胞极显著增加(P<0.01),G2期细胞显著增加(P<0.05)或有增加趋势,而F+4.0N组G1期细胞极显著增加(P<0.01),S期细胞极显著减少(P<0.01)。综上所述,L-型钙通道拮抗剂Nifedipine通过抑制过量ROS产生、细胞内钙超载、Fas/FasL信号通路的激活以及影响细胞周期,有效调控PC12细胞凋亡异常。表明Nifedipine对氟致钙超载诱导的细胞异常凋亡具一定干预作用,可能是一种新型有效的抗氟药物。