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目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)的并发症之一,大量实验研究表明糖尿病肾病的机制和炎症有关。本实验研究石榴皮鞣质的重要单体——鞣花酸(Ellagicacid,EA)对糖尿病肾病的作用,并阐明鞣花酸及其代谢产物对糖尿病肾病的作用机制。方法:1)ICR小鼠分为正常组(SHAM),模型组(MODEL),厄贝沙坦组(IRB),鞣花酸低剂量组(LEA),鞣花酸中剂量组(MEA),鞣花酸高剂量组(HEA)。除正常组外,其余小鼠单次腹腔注射180mg/kg链脲霉素(streptomycin,STZ)以制备糖尿病肾病模型。确认DN模型成功后4周,LEA组给予鞣花酸50mg/kg干预,MEA组给予鞣花酸100mg/kg干预,HEA组给予鞣花酸150mg/kg干预,IRB组给予20mg/kg厄贝沙坦,正常组及模型组给予同剂量的生理盐水,给药方式为灌胃。连续给药4周。收集24h尿、采血清,取肾脏组织,制备肾组织匀浆。每周测小鼠体重和血糖,ELISA法测定24h尿中微量白蛋白含量、血清中肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)含量,通过相应试剂盒测定尿样和血清中尿素氮和肌酐水平,肾组织和血清中总超氧化物歧化酶(Total-Superoxide Dismutase,T-SOD)和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量,用Vestern Blot法测定小鼠肾组织中 TLR4、IRAK4、TRAF6、IKKβ、NF-KbP65、HMGB1 的含量,肾组织行HE和PAS染色。2)培养大鼠肾脏NRK-52E细胞,用不同浓度的LPS刺激细胞,免疫荧光法测定不同浓度的LPS对细胞TLR4分泌的刺激作用。向LPS刺激的细胞加入不同浓度的Urolithin A(UroA),免疫荧光观察Toll样受体(Toll-like receptor 4,TLR4)的分泌是否减少。另预先用 100mg/mlEA、200mg/mlUroA、100mg/ml UroA及5umol/L TLR4抑制剂TAK-242孵育细胞,再用LPS刺激细胞后,通过western blot 测定 TLR4、IRAK1 和 NF-κb p65 的蛋白含量。结果:1)LEA,MEA,HEA及IRB组小鼠的日常精神状态明显好转,体重较模型组有所增加,但无显著差异,血糖略有所下降,但也无显著性差异。IRB和各剂量EA均未改善肾脏指数。ELISA法测定24h尿微量白蛋白,结果发现IRB组、MEA和HEA组均能显著降低尿中微量白蛋白水平(p<0.01),回至正常水平。病理切片染色结果表明IRB,LEA,MEA,HEA均能不同程度的改善DN小鼠的肾脏病理。通过ELISA测定血清中TNF-α,发现各剂量EA能剂量依赖性的减少DN小鼠体内的TNF-α水平(p<0.01),且效果优于IRB。本造模方法使血肌酐、血BUN显著上升(p<0.01),而尿肌酐、尿BUN显著下降(p<0.01)。中剂量和高剂量的EA能使尿肌酐显著升高(p<0.01),血清肌酐显著降低(p<0.01),而各剂量EA对血和尿中BUN的改善不是很明显。模型组肾组织中MDA和T-SOD与正常组无差异,而在血清中,模型组T-SOD活性明显下降,MDA明显上升,各剂量EA血清中T-SOD活性下降及MDA的上升可以显著改善(p<0.05,p<0.01)。通过western blot法测定各组小鼠肾组织中TLR4、IRAK4、TRAF、IKKβ、NF-κbp65、HMGB1蛋白含量,发现模型组小鼠肾组织中这些蛋白均明显增多,LEA、MEA、HEA剂量依赖的减少肾组织中这几种蛋白的表达,厄贝沙坦减少最为明显。2)通过细胞爬片,免疫荧光染色结果发现,TLR4主要在细胞包浆内表达。1.0mg/ml和0.lmg/ml的LPS刺激使细胞中TLR4的表达明显升高,2000μg/ml,100μg/ml,50μg/ml 25μg/ml 的 UroA 对 0.1mg/mlLPS 刺激细胞产生的 TLR4 表达有不同程度的抑制作用。Western blot定量结果表明,100 mg/ml EA,200 mg/ml UroA,100 mg/ml UroA对LPS诱导的TLR4升高及TLR4下游蛋白表达升高有明显的抑制作用,且 200mg/ml UroA 和 100mg/mlEA 对 TLR4、IIRAK4 及 NF-κb p65均有明显的抑制作用(p<0.01),但抑制作用比TLR4抑制剂TAK242弱。结论:推测鞣花酸通过抗氧化作用使机体内过多的ROS减少,从而减少TNF-α等炎症因子的产生,通过下调HMGB1/TLR4/NF-κb通路,缓解DN带来的机体的炎症。UrolithinA使鞣花酸的主要代谢产物之一,UrolithinA可以明显减少LPS诱导的TLR4表达升高,因此由此推测鞣花酸对糖尿病肾病的改善作用与Urolithin A密切相关。