论文部分内容阅读
第一部分环磷酰胺诱导免疫低下BALB/c小鼠RSV感染动物模型的建立目的:为了建立RSV感染动物模型,采用环磷酰胺诱导免疫低下的BALB/c小鼠,观察是否对低浓度RSV的易感性,此模型更接近临床患者感染RSV的情况。方法:BALB/c小鼠分为Control(PBS)组、PBS+RSV组及环磷酰胺+RSV组(CYP+RSV组),每组10只。CYP+RSV组给予环磷酰胺100mg/kg腹腔注射,Control组、PBS+RSV组给予同剂量PBS腹腔注射,每天称体重。环磷酰胺注射第5d,在10%水合氯醛3ml/kg麻醉下,PBS+RSV组、CYP+RSV组给予RSV 3.4×10~6PFU/ml,100μl滴鼻,Control组给予培养Hep-2细胞上清液100μl,随机选取每组中的3只小鼠称体重至RSV感染后15d,其余均在RSV感染后第5天处死取标本。肺泡灌洗液细胞计数及分类,H&E染色观察肺组织病理炎症并进行炎症评分,空斑实验检测小鼠肺组织匀浆RSV病毒滴度,为进一步探讨环磷酰胺对BALB/c小鼠淋巴细胞免疫反应,采用流式细胞技术检测肺淋巴细胞分类百分比。结果:CYP+RSV组体重比PBS+RSV组明显降低,BALF中细胞计数显示CYP+RSV组小鼠比PBS+RSV组小鼠细胞总数明显增多,且淋巴细胞比例也增高,巨噬细胞比例降低;H&E染色病理炎症CYP+RSV组小鼠较PBS+RSV组小鼠白细胞浸润更加严重,病理炎症评分较高;CYP+RSV组小鼠肺组织匀浆病毒滴度比PBS+RSV组小鼠肺组织滴度增高;流式细胞技术结果显示环磷酰胺处理小鼠后CD19比例明显降低,CD49b比例有所增加,CD3比例两组比较无明显差异;RSV感染后,CYP+RSV组较PBS+RSV组CD19比例显著降低,但是与CYP组相比无明显差异,CD49b比例CYP+RSV组与PBS+RSV组无明显差异,CD3比例CYP+RSV组与CYP组及PBS+RSV组相比有所升高。结论:环磷酰胺处理后诱导免疫低下小鼠感染RSV肺组织炎症更重,病毒滴度较高,提示免疫低下小鼠对低浓度RSV易感,可能与环磷酰胺处理后抑制小鼠肺B淋巴细胞,使得免疫反应降低,抗体的产生减少有关。第二部分白藜芦醇对RSV感染诱发气道炎症和气道高反应性的作用目的:观察白藜芦醇对RSV感染环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠气道炎症和气道高反应性的变化,研究白藜芦醇对RSV诱导的气道炎症和气道高反应性的作用。方法:BALB/c小鼠分为Control组、RSV+PBS组、RSV+RES组,每组8只:RSV+RES组:环磷酰胺注射第5d,感染RSV,1-2h后给予白藜芦醇30mg/kg腹腔注射,连续给药5d。RSV+PBS组:环磷酰胺注射第5d,感染RSV,1-2h后给予PBS(剂量同白藜芦醇)腹腔注射,连续注射5d。Control组:环磷酰胺注射第5d,RSV病毒对照液滴鼻,1-2h后给予PBS(剂量同白藜芦醇)腹腔注射,连续注射5d。体积描述记法检测各组小鼠气道高反应性,BALF中细胞计数及白细胞分类,空斑实验检测肺组织匀浆RSV病毒滴度,H&E染色检测小鼠肺组织病理炎症并进行组织形态学炎症评分。结果:白藜芦醇干预RSV感染后小鼠,RSV+RES组小鼠肺组织匀浆RSV病毒滴度比RSV+PBS组明显降低;BALF中细胞总数RSV感染后均较Control组明显增多,淋巴细胞比例明显增高,巨噬细胞比例明显减少,给予白藜芦醇后,RSV+RES组与RSV+PBS组相比,BALF中细胞总数明显减少,淋巴细胞比例明显降低,巨噬细胞比例明显增高;H&E染色病理组织炎症,RSV感染后炎症细胞浸润明显加重,炎症病理评分比Control组明显增高,给予白藜芦醇后,RSV+RES组与RSV+PBS组相比,炎症细胞浸润明显减轻,炎症病理评分显著降低;小鼠吸入乙酰甲胆碱浓度12.5mg/ml-50mg/ml时气道高反应性,RSV感染后比Control组显著升高,给予白藜芦醇后,小鼠吸入乙酰甲胆碱浓度12.5mg/ml-50mg/ml时气道高反应性,RSV+RES组较RSV+PBS组明显降低,但与Control组相比仍有所增高。结论:白藜芦醇干预RSV感染后小鼠,能够降低小鼠肺组织匀浆RSV病毒滴度,抑制RSV在体内复制,减轻RSV感染诱导的肺部炎症,缓解RSV感染诱导的气道高反应性。第三部分白藜芦醇抑制RSV诱导气道炎症和气道高反应性的机制探讨目的:研究IFN-γ在白藜芦醇抑制RSV感染所致气道炎症和气道高反应性中的作用,探讨白藜芦醇抑制RSV诱导气道炎症和气道高反应性的可能机制。方法:BALB/c小鼠分为Control组、RSV+PBS组、RSV+RES组,每组8只:RSV+RES组:环磷酰胺注射第5d,感染RSV,1-2h后给予白藜芦醇30mg/kg腹腔注射,连续给药5d。RSV+PBS组:环磷酰胺注射第5d,感染RSV,1-2h后给予PBS(剂量同白藜芦醇)腹腔注射,连续注射5d。Control组:环磷酰胺注射第5d,RSV病毒对照液滴鼻,1-2h后给予PBS(剂量同白藜芦醇)腹腔注射,连续注射5d。ELISA法检测BALF中炎症因子、细胞因子表达,Q-PCR检测TLR3和M2受体的基因表达,Western blot检测TRIF蛋白表达,为进一步检测IFN-γ在RSV诱导的气道炎症和气道高反应性的作用,RSV感染后用IFN-γ单抗中和IFN-γ表达,检测BALF中细胞计数及白细胞分类,体积描述记法检测小鼠气道高反应性。结果:RSV感染小鼠后,BALF中IFN-γ表达较Control组显著升高,IL-17,IL-4,IL-10,IL-12,IL-6表达均无明显差异,给予白藜芦醇干预后,IFN-γ表达水平RSV+RES组比RSV+PBS组明显降低,与Control组相比无明显变化,IL-17,IL-4,IL-10,IL-12,IL-6表达均无显著差异;给予IFN-γ单抗后,BALF中细胞总数较RSV+PBS组明显减少,淋巴细胞比例有所降低,巨噬细胞比例有所升高;吸入乙酰甲胆碱浓度12.5mg/ml-50mg/ml时,小鼠气道高反应性明显降低,但RSV + anti-IFN-γ组较Control组有所升高;Q-PCR结果显示RSV感染后小鼠肺组织TLR3表达明显上调,M2受体表达明显下降,给予白藜芦醇干预后,TLR3受体表达有所下调,M2受体表达有所上调,但是给予IFN-γ单抗后M2受体表达无明显变化;Western blot结果显示RSV感染后小鼠肺组织TRIF蛋白表达明显增高,给予白藜芦醇干预后TRIF表达,RSV+RES组较RSV+PBS组显著降低。结论:IFN-γ在RSV诱导的气道炎症和气道高反应性中起重要作用,白藜芦醇抑制RSV感染诱导的气道炎症和气道高反应性是通过减少RSV诱导的IFN-γ产生,这可能与白藜芦醇抑制RSV感染后TLR3/4通路中TRIF蛋白表达有关。