目的:探讨琼玉膏(由生地黄、蜂蜜、茯苓、人参4种成分组成)对H202诱导氧化损伤的斑马鱼血清超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、肾组织丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平,肾组织Klotho基因和蛋白表达水平,肾组织Klotho基因甲基化水平的影响情况,探究Klotho/FGF-23信号通路在琼玉膏延缓斑马鱼衰老中发挥作用的分子机制,开拓琼玉膏抗衰老分子机制研究的新领域。方法:模型:选取3月龄成年斑马鱼H202刺激,检测4周存活率和氧化应激水平。同时观察7个不同浓度琼玉膏对斑马鱼存活率的影响。确定最佳H202浓度,设立琼玉膏高、中、低浓度用于后续研究,并确定正式实验高、中、低浓度具体琼玉膏浓度值。分组:共5组,A:正常对照组,B:模型组(200 μ M H202),C:低浓度琼玉膏组(100 μ g/ml琼玉膏+200 u M H202),D:中浓度琼玉膏组(200 μ g/ml琼玉膏+200 μ M H202),E:高浓度琼玉膏组(400 μ g/ml琼玉膏+200μM H202),每组斑马鱼20尾(雌雄各半)。饲养与给药方法:成鱼于28℃恒温系统集中养殖与繁育,PH=7.2～7.6,水电导率550～650 μ s/cm,流动水,明暗交替变化比例为14H:10H。饲料喂养:每日两次,孵化脱壳丰年虾。给药方法:模型组斑马鱼每天8:00am～16:00pm用纯净养殖水孵育8h,16:00pm～次日8:00am用200 μ M过氧化氢养殖水孵育16h,持续6周;低、中、高浓度琼玉膏组斑马鱼每天8:00am～16:00pm分别用100 μ g/ml、2 00 μ g/ml、4 00 μ g/ml琼玉膏养殖水孵育8h,16:00pm～次日8:00am用200 μM过氧化氢养殖水孵育16h,持续6周。检测指标及对应方法:(1)生化试剂盒检测超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA)水平;(2)实时定量PCR(Real time PCR)检测Klotho基因表达水平;(3)免疫印迹法(Western blotting)检测Klotho蛋白表达水平;(4)甲基特异性PCR(Methylmion specific PCR,MSP)检测Klotho基因甲基化水平。结果:1.琼玉膏浓度梯度预实验结果:0 μ g/ml、100 μ g/ml、200 μ g/ml、400 μ g/ml组,3月龄斑马鱼4周存活率均为100%;琼玉膏浓度为800 μ g/ml、1600 μ g/ml、3200μ g/ml时,3月龄斑马鱼4周存活率低于100%,从数据结果分析,琼玉膏浓度达到800 μ g/ml时可能药物浓度过高,我们确定琼玉膏浓度梯度为:100 μ g/ml为低浓度琼玉膏组,200 μ g/ml为中浓度琼玉膏组,400 μ g/ml为高浓度琼玉膏组。H2O2浓度梯度预实验表明,H2O2浓度在200 μM以下时,斑马鱼4周存活率均为100%,随着H2O2浓度在400 μM或以上时,斑马鱼出现死亡,从结果分析,我们确定选用浓度为200μM H202作为建模衰老斑马鱼的氧化剂。2.斑马鱼血清SOD结果:多组间差异具有显著统计学意义(P=0.000,P<0.01)。对照组与实验组间Dunett(邓尼特)检验显示:模型组vS正常对照组,P=0.000;低浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.000;中浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.000;Evs正常对照组,P=0.090;以上数据表明低浓度琼玉膏组及中浓度琼玉膏组SOD值明显低于正常对照组SOD值,且差异有显著统计学意义,P<0.01;而高浓度琼玉膏组SOD值几乎接近正常对照组SOD值,差异无统计学意义,P>0.05,反映高浓度琼玉膏干预下,衰老斑马鱼中的抗氧化酶SOD几乎接近正常值,抗氧化效果较确切。模型组与实验组间Bonferroni(邦弗伦尼)检验显示:模型组vs低浓度琼玉膏组,P=1.000;模型组vs中浓度琼玉膏组,P=0.000;模型组vs高浓度琼玉膏组,P=0.000;低浓度琼玉膏组vs中浓度琼玉膏组,P=0.001;低浓度琼玉膏组vs高浓度琼玉膏组,P=0.000;中浓度琼玉膏组vs高浓度琼玉膏组,P=0.000;以上数据表明低浓度琼玉膏对提高已造成氧化衰老斑马鱼SOD值无明显效果,差异无统计学意义,P>0.05;但中浓度琼玉膏组及高浓度琼玉膏组对提高衰老斑马鱼SOD值有明显效果,且高浓度琼玉膏效果优于中浓度琼玉膏,差异有显著统计学意义,P<0.01。3.斑马鱼肾组织MDA结果:多组间差异具有显著统计学意义(P=0.000,P<0.01),对照组与实验组间Dunett(邓尼特)检验显示:模型组vs正常对照组,P=0.000;低浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.000;中浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.000;高浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.018;以上数据表明低、中、高三个浓度琼玉膏组MDA值与正常对照组MDA值间差异有统计学意义,P<0.05,反映低、中、高三个浓度琼玉膏组干预下均未能使衰老斑马鱼中的自由基MDA值下降到接近正常水平。模型组与实验组间Bonferroni(邦弗伦尼)检验显示:模型组vs低浓度琼玉膏组,P=1.000;模型组vs中浓度琼玉膏组,P=0.001;模型组vs高浓度琼玉膏组,P=0.000;低浓度琼玉膏组vs中浓度琼玉膏组,P=0.002;低浓度琼玉膏组vs高浓度琼玉膏组,P=0.000;中浓度琼玉膏组vs高浓度琼玉膏组,P=0.056;以上数据表明低浓度琼玉膏组MDA值与模型组MDA值间差异无统计学意义,P>0.05,反映低浓度琼玉膏对降低已衰老斑马鱼MDA值效果不明显;中浓度琼玉膏组及高浓度琼玉膏组对降低已衰老斑马鱼MDA值效果较为确切,差异有显著统计学意义,P<0.01,但中浓度琼玉膏组效果与高浓度琼玉膏组间差异无统计学意义,P>0.05,这反映可能琼玉膏浓度达到200 μ g/ml以后,增加琼玉膏浓度并不能增加其降低衰老斑马鱼MDA值的效果。4.Real time PCR反应体系检测肾组织Klotho基因表达结果:多组间差异具有显著统计学意义(P=0.000,P<0.01),对照组与实验组间Dunett(邓尼特)检验显示:模型组vs正常对照组,P=0.000,低浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.000,中浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.000,高浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.209,以上数据表明,低浓度琼玉膏组及中浓度琼玉膏组肾Klotho基因表达水平与正常对照组间差异有显著统计学意义,P<0.01,而高浓度琼玉膏组肾Klotho基因表达水平与正常对照组间差异无统计学意义,P>0.05,反映低浓度琼玉膏及中浓度琼玉膏对增加肾组织Klotho基因表达效果不确切,但高浓度琼玉膏增加肾组织Klotho基因表达效果较为明显。模型组与实验组间Bonferroni(邦弗伦尼)检验显示:模型组vs低浓度琼玉膏组,P=1.000;模型组vs中浓度琼玉膏组,P=0.000;模型组vs高浓度琼玉膏组,P=0.000;低浓度琼玉膏组vs中浓度琼玉膏组,P=0.000;低浓度琼玉膏组vs高浓度琼玉膏组,P=0.000;中浓度琼玉膏组vs高浓度琼玉膏组,P=0.000;以上数据表明低浓度琼玉膏对促进衰老斑马鱼的肾Klotho基因表达无明显效果,差异无统计学意义,P>0.05,但中浓度琼玉膏及高浓度琼玉膏对促进衰老斑马鱼的肾Klotho基因表达有明显效果,且高浓度琼玉膏组优于中浓度琼玉膏组,差异有显著统计学意义,P<0.01。5.Westen blotting检测肾组织Klotho蛋白表达结果:多组间差异具有显著统计学意义(P=0.000,P<0.01),对照组与实验组间Dunett(邓尼特)检验显示:模型组vs正常对照组,P=0.000,低浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.000,中浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.002,高浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.095;以上数据表明,低、中浓度琼玉膏组肾Klotho蛋白表达水平与正常对照组肾Klotho蛋白表达水平差异有显著统计学意义,P<0.01,但高浓度琼玉膏组肾Klotho蛋白表达水平与正常对照组肾Klotho蛋白表达水平差异无统计学意义,P>0.05,反映只有高浓度琼玉膏能使衰老斑马鱼肾Klotho蛋白表达水平接近正常水平。模型组与实验组间Bonferroni(邦弗伦尼)检验显示:模型组vs低浓度琼玉膏组,P=1.000;模型组vs中浓度琼玉膏组,P=0.006;模型组vs高浓度琼玉膏组,P=0.000;低浓度琼玉膏组vs中浓度琼玉膏组,P=0.038;低浓度琼玉膏组vs高浓度琼玉膏组,P=0.001;中浓度琼玉膏组vs高浓度琼玉膏组,P=0.382;以上数据表明,低浓度琼玉膏组肾Klotho蛋白表达水平与模型组肾Klotho蛋白表达差异无统计学意义,P>0.05,而中、高浓度琼玉膏组与模型组间肾Klotho蛋白表达水平差异有统计学意义,P<0.05,反映低浓度琼玉膏对增加易造成衰老的斑马鱼肾Klotho蛋白表达水平无明显效果,而中浓度琼玉膏及高浓度琼玉膏对增加易造成衰老的斑马鱼肾Klotho蛋白表达水平有较明显效果,且高浓度琼玉膏优于中浓度琼玉膏,差异有统计学意义,P<0.05。6.甲基特异性 PCR(Methylmion specific PCR,MSP)检测肾组织 Klotho 基因甲基化结果:在正常:对照组中,表现为部分甲基化,在模型组和低中剂量组表现为全甲基化,在高剂量琼玉膏组表现为部分甲基化。结论:在过去琼玉膏抗衰老机制研究的基础上,对新的动物模型斑马鱼完善了的琼玉膏浓度梯度预实验,通过观察比较成年斑马鱼的成活率,最终选取100 μ g/ml为低浓度琼玉膏组,200 μg/ml为中浓度琼玉膏组,400 μ g/ml为高浓度琼玉膏组,探索确定了诱导斑马鱼衰老的适当H202浓度为200 μ M。在抗氧化相关指标衰老斑马鱼血清SOD以及肾MDA自由基生产量研究中,可发现中浓度琼玉膏及高浓度琼玉膏对提高氧化衰老斑马鱼SOD值有明显效果,且高浓度琼玉膏效果优于中浓度琼玉膏,高浓度琼玉膏可将衰老斑马鱼血清SOD提高至与正常对照组水平,抗氧化效果较明显。中浓度琼玉膏组及高浓度琼玉膏组对降低氧化衰老斑马鱼MDA值效果较为明显,但琼玉膏浓度达到中浓度200 μ g/ml以后,增加琼玉膏浓度并不能增加其降低衰老斑马鱼MDA值的效果,且低、中、高三个浓度琼玉膏组对降低衰老斑马鱼MDA值均未能达到正常对照组水平。综上所述,琼玉膏对提高衰老斑马鱼抗氧化酶并使其自由基得到一定量清除,证明了琼玉膏可能通过抗氧化应激损伤从而延缓衰老的机制。在过去sirtl/p53信号通路研究琼玉膏延缓斑马鱼衰老的研究基础上,本实验创新研究衰老斑马鱼Klotho/FGF-23信号通路,并发现琼玉膏可提高衰老斑马鱼Klotho基因及蛋白的表达水平,还可一定程度上逆转衰老斑马鱼肾组织Klotho基因甲基化水平,为琼玉膏抗衰老分子机制研究开拓了新的领域。关于琼玉膏抗衰老的机制研究,笔者的导师及其团队在过去10年做了很多工作,对琼玉膏抗衰老蛋基因组学、蛋白组学及代谢组学等方面有丰富的研究基础,过去实验发现琼玉膏的组方虽然简约,却具有很好抗氧化、抗衰老、美容等功效,从中医机制而言,琼玉膏通过健脾补肾,起到充养先天补后天,调补后天以滋养先天的作用;从现代医学机理而言,琼玉膏可能通过逆转抗衰老基因的甲基化、抗氧化、促进抗衰老基因及蛋白的表达,从而促进相关信号通路的表达,起到延缓衰老的作用。本课题是建立在过去研究的基础上不断创新,在导师“全养生”理念指导下,不断更全面、更深入研究,预期通过科研实验,将琼玉膏这一经典养生古方转化为人们可方便使用的养生保健产品、用品。抗衰老工程是一个系统工程,应当涵盖我们的日常生活、衣食住行等方方面面,琼玉膏是我们研究食疗养生、美容养生等具体养生方式的一个有巨大潜力的切入点,为更全面满足日益增长的人们对健康和美丽的需求,作为古方研究者,应该不断革新、创新研究方法和实践方法,古为今用,为当下我国人口老龄化问题以及粤港澳大湾区经济和社会的健康可持续发展作更大贡献。