鱼类胚胎冷冻保存对鱼类种质资源保护、低温生物学、遗传育种和水产养殖业都具有重要的意义。牙鲆(Paralichthys olivaceus)是重要的经济鱼类,本文以牙鲆胚胎为材料,对玻璃化中所涉及到的主要影响因素:适宜胚胎发育阶段的选择、适宜抗冻剂的选择、麦管的适宜长度和盛装抗冻剂体积等,以及显微注射法中涉及到的抗冻剂毒性、抗冻剂注射剂量等影响胚胎冷冻保存的主要环节进行了研究。结果表明:将囊胚期、原肠中期、胚孔封闭期、15-20对肌节期、尾芽期、心跳期、出膜前期几个时期的牙鲆胚胎分别浸泡在6M的PM(PG:MeOH=2:1 v/v)抗冻剂中,尾芽期胚胎的成活率最高,耐受能力最强,是较适宜进行冷冻保存的胚胎阶段。室温下,PG、MeOH、DMSO、EG、DMF、GLY六种抗冻剂通过浸泡尾芽期胚胎而得出它们相对的毒性排列(由弱到强)为PG﹤MeOH﹤DMSO﹤DMF﹤EG﹤GLY;而在0℃下,这几种抗冻剂的毒性会有所减弱,反映在胚胎的成活率有所提高,但几种抗冻剂毒性相对排列不变。将毒性最小的PG,与MeOH、与DMSO分别混合浸泡胚胎,发现(两种)混合后的抗冻剂所得到的胚胎成活率较单一抗冻剂有所提高,混合后的抗冻剂对胚胎毒性有所降低。将4M的PM分别与PVP、Dextran、Ficoll三种抗冻剂混合后,发现混有Fiocll的胚胎成活率最高,Dextran的最低,它们对胚胎的毒性相对排列为Ficoll﹤PVP﹤Dextran;而PM与DMSO、DMF分别混合后,DMSO的成活率较高,毒性较小。利用三种规格的麦管5cm、7.5cm、10cm(长度)分别进行有卵和无卵的玻璃化冷冻实验,发现5cm的麦管玻璃化效果最好,另外,麦管盛装的玻璃化液体积为50ul时玻璃化效果最佳。目前,鱼类胚胎冷冻保存仍未达到应用性水平,由于鱼类胚胎体积大、卵膜通透性差等特点,传统的平衡法,无法使抗冻剂足够、有效的进入胚胎内部起到保护胚胎的作用。利用显微注射技术,可直接将抗冻剂注射到鱼类胚胎卵黄囊内,一定程度上弥补了普通平衡法的不足,而且提高了抗冻剂对胚胎的保护程度。本研究对显微注射过程中的抗冻剂注射剂量、抗冻剂毒性等影响因素进行了探索研究。发现:牙鲆胚胎较适宜的显微注射剂量为750pl。DMSO、MeOH、PG、PVP、蔗糖几种抗冻剂注射牙鲆胚胎后的毒性大小相对排列为DMSO > MeOH > PG, PVP>蔗糖,其中注射PG获得的胚胎成活率和孵化率最高,注射PVP获得的胚胎成活率和孵化率最低,而PG与MeOH组成混合抗冻剂PM毒性更低获得的胚胎成活率和孵化率更高。而任何一种抗冻剂均随着浓度的增加其毒性随之增加。在冷敏感实验中,显微注射6M的PM的胚胎,应用程序化法处理,以2℃/min的速率降至-20℃,平衡10min后解冻处理,发现注射PM的胚胎低温处理后成活率为25.07±1.57%,而6M的PM五步平衡法同步处理的对照组胚胎成活率为20.88±2.84%,说明显微注射的胚胎冷敏感性有所降低。在以上条件优化的基础上,本研究应用玻璃化法、以及显微注射法对牙鲆胚胎进行了超低温冷冻保存。在应用玻璃化方法对牙鲆胚胎超低温冷冻保存中,共得到了7次尾芽期成活胚胎,1次心跳期成活胚胎,共获得23粒复活胚胎,平均成活率为8.91%,其中14粒胚胎孵化出苗,孵化率为61.25%,有7尾正常鱼苗,复活胚胎中成活时间最长为84h。另外,应用已筛选出的最优条件,以35%PM和0.8%的PVP的不同体积配比,对大菱鲆心跳期胚胎进行了尝试性超低温冷冻保存,冷冻存活1次,共8粒胚胎,成活率为21.05%(8/38),其中有一粒孵化出膜。除此之外,在应用显微注射这个新方法对牙鲆尾芽期胚胎进行低温和超低温冷冻保存过程中,虽然超低温保存中并未取得复活胚胎,但透明胚较高,胚胎完整性良好,解剖镜下观察,卵黄稍收缩,褶皱,卵黄膜基本完好,卵黄无外流,胚体外形无损伤。