【摘 要】
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苹果病毒病害是制约苹果优质高效可持续生产的重要限制因素之一。目前,尚无治疗苹果病毒病害的有效方法,因此,使用无病毒种苗是苹果病毒病防治最重要的方法,而建立简易高效的苹果病毒检测及脱除技术是繁育和利用脱毒苗的必要前提。本研究旨在（1）建立苹果潜隐性病毒的多重RT-PCR检测技术;（2）建立苹果茎沟病毒（Apple Stem Grooving Virus,ASGV）的反转录重组酶聚合酶扩增（Recom
【基金项目】
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国家苹果产业技术体系苗木繁育与栽培方式岗位（CARS-27）； 国家重点研发计划子课题（2019YFD1000803）； 陕西省科技重大专项子课题（2020zdzx03-01-04）；
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苹果病毒病害是制约苹果优质高效可持续生产的重要限制因素之一。目前,尚无治疗苹果病毒病害的有效方法,因此,使用无病毒种苗是苹果病毒病防治最重要的方法,而建立简易高效的苹果病毒检测及脱除技术是繁育和利用脱毒苗的必要前提。本研究旨在（1）建立苹果潜隐性病毒的多重RT-PCR检测技术;（2）建立苹果茎沟病毒（Apple Stem Grooving Virus,ASGV）的反转录重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification,RT-RPA）,侧流层析试纸条检测（Lateral Flow Dipstick,LFD）技术,为苹果病毒的田间检测提供基础;（3）测试外施水杨酸（Salicylic acid,SA）在脱除ASGV和苹果褪绿叶斑病毒（Apple Cholorotic Leaf Sopt Virus,ACLSV）的效果,并初步解析其脱毒机理。主要结果如下:（1）建立并优化了多重RT-PCR检测体系。以感染ASPV（Apple stem pitting virus）、ASGV和ACLSV的‘烟富8号’样品c DNA为模板,反应体系为25μL。首先反应条件优化,确定体系中加入1μL 10μM上下游引物,2μL c DNA,在退火温度（Tm）57℃下进行35个循环为最佳反应条件。其次进行反应灵敏性对比和特异性验证,结果显示单一RT-PCR较多重RT-PCR灵敏10倍,且具有特异性。最后以田间样品验证多重RT-PCR检测可靠性,结果显示多重RT-PCR的病毒检测结果与单重RT-PCR几乎一致,当ASGV病毒浓度较低时,多重RT-PCR检测不到。（2）研究建立了基于重组酶聚合酶扩增（RPA）的高效ASGV检测技术。本研究以单感ASGV的‘嘎啦’为试材,RNA为模板,扩增体系中加入M-MLV反转录酶,使反转录和扩增同步进行。首先反应条件优化,结果表明在40℃下孵育30 min扩增效果最好;其次进行反应灵敏性对比和特异性验证,将500 ng/μL RNA 10倍梯度稀释,结果显示RT-RPA检测方法比RT-PCR灵敏100倍,特异性验证显示只有感染ASGV的样品检测为阳性。最后,利用一种简单、廉价且快速的RNA粗提取方法,直接从苹果叶片上粗提取RNA,一步法RT-RPA检测苹果ASGV。将该方法用于试管苗和田间样品检测,检测结果与RT-PCR的结果一致,表明一步法RT-RPA法可以用于苹果ASGV检测。（3）研究外源水杨酸SA在热疗法结合茎尖培养和茎尖超低温疗法脱除苹果苹果ASGV和苹果ACLSV中的作用。本研究以双感ASGV、ACLSV的‘烟富8号’为试验材料,首先在0、1、10、50和100μM的浓度梯度下筛选最佳的SA浓度,结果表明外源10μM水杨酸处理能够显著降低植株中的病毒含量且生长不受影响。其次以10μM SA处理2周后的组培苗变温热处理,结果显示外施SA的热处理,病毒含量下降更为显著,病毒检测结果表明水杨酸处理和对照组均能在热处理后获得100%的病毒脱除率,且水杨酸处理组的再生率为89%,高于不添加水杨酸的75%。本研究还在热处理结合茎尖超低温冷冻的试验中发现添加10μM SA的处理组能够得到13%的再生率和100%的病毒脱除率,而不添加水杨酸的对照组再生率为7%。最后对比10μM SA与25μM利巴韦林（R）和30μM硝普钠（SNP）处理结合热处理的脱毒效果,结果显示SA、R和SNP处理脱毒率均为100%,但SA处理的再生率较R和SNP处理高。这些结果表明SA能够降低苹果植株中的病毒含量,在不影响脱毒率的情况下提高热处理结合茎尖培养和茎尖超低温疗法的再生率。
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