微生物来源的天然产物具有多种生物活性,被广泛应用于医药、农业、食品等领域,如抗生素青霉素、免疫抑制剂他克莫斯、畜禽专用抗生素泰乐菌素、食品防腐剂纳他霉素等。通过分离培养微生物来获得新的活性天然产物是一种传统的研究方法,但是随着许多活性天然产物已经被发现,经传统方法获得新化合物的速率逐渐下降,化合物的重复发现成为问题,其中一个主要原因是环境中大部分的微生物在现有实验室条件下无法有效培养。充分利用这些不可培养的微生物资源则需要新的研究策略。宏基因组学技术直接提取环境样品中微生物总基因组DNA,与载体连接后转化到可培养的宿主中建立宏基因组文库,文库中含有环境中全部的微生物基因资源,包括天然产物的生物合成基因,增加了获得新的活性天然产物的机会。微生物来源的聚酮化合物,如抗肿瘤药物阿霉素、抗生素四环素、免疫抑制剂雷帕霉素等,是一类有着多种生物活性,在食品、畜牧以及医药领域有着广泛应用的化合物。通过基于序列的宏基因组学技术,挖掘聚酮生物合成基因簇资源,可以发现新的聚酮类天然产物。本研究利用基于Ⅰ型聚酮合酶中的酮基合成功能域(KS)、酰基转移功能域(AT)和Ⅱ型聚酮合酶中“最小PKS”基因的保守序列设计的简并引物筛选土壤宏基因组文库,获得含有聚酮生物合成基因簇的阳性克隆。通过接合转移方法将基因簇整合进异源表达宿主白色链霉菌和天蓝色链酶菌基因组中,培养发酵接合子,利用高效液相色谱分析确定克隆特异性产物并分离获得化合物纯品,通过质谱及核磁共振技术解析化合物结构,发现土壤微生物来源的聚酮类化合物。本实验从云南土壤宏基因组文库中通过PCR扩增得到22个Ⅰ型聚酮KS片段,同源比对分析表明筛选得到的KS与GenBank数据库中的KS序列相似性大都低于80%,其中比较特殊的是YN1207,其与trans-AT类Ⅰ型聚酮中的KS同源,相似性为67%;经进化树分析,YN1201与安莎类Ⅰ型聚酮聚为一簇,YN1200、YN1205、YN1517与PKS/NRPS杂合的Ⅰ型聚酮聚为一簇。在此基础上筛选文库,获得34个含有Ⅰ型聚酮生物合成基因簇的阳性克隆。通过接合转移使基因簇整合进白色链霉菌和天蓝色链霉菌宿主基因组中,高效液相色谱分析发酵粗提物发现克隆cosZF14在白色链酶菌宿主中的一个接合子在异源表达过程中产生了特异峰,产物为化合物14A(TOF MS m/z 178.0615 或 377.0957[M+H]+),14B(TOF MS m/z 587.3405[M+H]+),14C(TOF MS m/z 220.0721[M+H]+)。从珠穆朗玛峰土壤宏基因组文库中通过PCR扩增得到8个Ⅱ 型聚酮KSβ基因,经同源比对分析,ZF118与landomycinE聚酮合酶的KSβ有75%相似性,ZF197与抗生素grincamycin聚酮合酶的KSβ有75%相似性,ZF1089与抗生素grincamycin聚酮合酶的KSβ有76%相似性,ZF468与抗生素urdamycinA聚酮合酶的KSβ有75%相似性,ZF344与化合物JBIR-76-77聚酮合酶的KSβ有40%相似性,ZF484与抗肿瘤化合物medermycin的KSβ有70%相似性。在此基础上筛选文库得到7个含有Ⅱ 型聚酮生物合成基因簇的克隆。通过接合转移使基因簇整合进白色链霉菌和天蓝色链霉菌宿主基因组中获得结合子,高效液相色谱分析结合子的发酵粗提物发现含cosZF484的白色链霉菌产生了新化合物,通过分离发酵粗提物获得了 484A纯品(TOF MS m/z 827.4194[M+H]+),对化合物484A进行核磁共振分析,结合484A分子量确定其为具有新结构的Ⅱ型聚酮化合物;克隆特异产物中其他化合物的TOF MS m/z信号分别为811.4242[M+H]+,851.3777[M+H]+和 880.3315[M+H]+。对克隆 cosZF484 进行全序列测序和生物合成基因分析,发现基因簇内含有两个编码细胞色素P450的基因,在Ⅱ型聚酮生物合成中较为罕见。本实验通过基于序列的宏基因组学技术发现了来源于土壤微生物的新Ⅱ型聚酮化合物484A及其生物合成相关产物。