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生物体核酸相关酶活性及核酸是生物体生长发育、繁殖等正常生命活动必不可少的两类物质。研究表明,生物体核酸相关酶活性与生物体多种疾病如癌症、汤姆森氏综合征、Bloom综合征、神经退行性疾病等相关。建立生物体内核酸相关酶活性检测对于疾病早期筛查、临床诊断以及疾病预后处理意义重大。羊痘病毒（Capripoxvirus,CaPV）是牛羊常见皮肤病之一,可引起山羊痘、绵羊痘和牛结节性疹块病,被世界动物卫生组织列为通报疾病。传统核酸相关酶活性及CaPV检测方法存在依赖大型仪器设备、检测灵敏度有限、特异性不高、检测过程耗时、无法满足现场即时检测等缺点。因此,建立新的能高灵敏、快速、即时检测核酸相关酶活性及CaPV的方法仍是急需的。CRISPR/Cas体系用于分析检测,具备生理温度下识别目标物、特异性好、灵敏度高、操作简单、响应速度快、成本低廉、易于微型化和集成等优点,特别适用于复杂实际样本中低丰度靶标分子检测和POCT诊断部署。生物体核酸相关酶作用于核酸,使得核酸结构发生变化,为使用CRISPR/Cas体系检测其活性提供了条件。本文利用CRISPR/Cas12a体系结合新型生物放大技术建立了生物体多种核酸相关酶活性检测新技术。此外,考虑到CRISPR/Cas12a体系在核酸检测方面优势,本文将其与生物放大技术结合用于CaPV的高灵敏、快速、即时检测。具体研究工作如下:（1）基于末端脱氧核苷酸转移酶及CRISPR/Cas12a体系建立Dam甲基转移酶活性超灵敏检测（TdT-IU-CRISPR/Cas12a）。利用Dam甲基转移酶诱导TdT聚合产生聚“T”序列招募并激活多个CRISPR/Cas12a体系,实现信号级联放大。该检测方法可特异性检测Dam甲基转移酶活性至1.26×10-3 U/mL,线性范围为1.59×10-3～3.18×10-1 U/mL。相比于其它Dam甲基转移酶活性检测法,该方法在灵敏度上提高了一个数量级。该方法可用于Dam甲基转移酶活性抑制筛选。正常人血清样本中Dam甲基转移酶活性加标回收率在92.9～105.2%之间,RSD值为5.27%～7.57%,表明该方法在血清基质背景中具备良好的加标回收率。（2）基于增强型链置换扩增及CRISPR/Cas12a体系建立针对序列特异性核酸及尿嘧啶糖基转移酶活性的超灵敏检测平台。在优化条件下,该检测平台可特异性检测HIV-1 DNA至87.3 aM,线性检测范围为100 aM～5 pM;HIV-1 DNA重复实验RSD值为5.92%,表明该检测平台在序列特异性核酸检测方面稳定性良好;HIV-1 DNA在正常人血清中加标回收率在91.25%～114.75%之间,RSD值≤6.44%,表明该方法在血清基质背景中具备良好的加标回收率。在优化条件下,检测平台可特异性检测UDG活性至3.1×10-5 U/mL,线性检测范围为5.0×10-5至0.1 U/mL;UDG重复实验RSD值为5.83%,表明该检测平台在UDG活性检测方面稳定性良好;该检测平台可用于UDG抑制剂筛选;He La裂解液中UDG活性实验表明该检测平台可用于实际样本中UDG活性检测。（3）基于酶诱导产生激活链激活CRISPR/Cas12a反式切割活性建立针对酶活性（T4 PNK、端粒酶及APE1）的超灵敏、即时检测平台（Ed U-CRISPR/Cas12a）。所建荧光法可特异性检测T4 PNK活性至1.48×10-4 U/mL,线性范围为2.5×10-4～2.5 U/mL;所建试纸条法可裸眼、即时检测T4 PNK活性至2.5×10-3 U/mL;He La细胞中T4 PNK活性检测实验表明该检测平台可用于实际样本中T4 PNK活性检测。对于端粒酶活性检测,所建荧光法可特异性检测肝癌细胞中端粒酶活性至9.25×10~1 cells/mL,线性范围为9.25×10~1～9.25×10~5 cells/mL;所建试纸条法可裸眼、即时检测肝癌细胞中端粒酶活性至9.25×10~2 cells/mL;不同亚型肝癌细胞中端粒酶活性检测实验表明该检测平台可用于区分不同亚型肝癌细胞。对于APE1活性检测,所建荧光法可特异性检测APE1活性至2.52×10-4 U/mL,线性范围为2.5×10-3～2.5×10~1 U/mL;所建试纸条法可裸眼、即时检测APE1活性至2.5×10-2U/mL;He La细胞中APE1活性检测实验表明该检测平台可用于实际样本中APE1活性检测。（4）基于环介导等温扩增及CRISPR/Cas12a体系建立CaPV的超敏感、即时检测。所建荧光法可特异性检测CaPV至1.47×10-3 TCID50;所建试纸条法可特异性检测CaPV至1.47×10-2 TCID50。所建荧光法及试纸条法对41个模拟临床样本和实际样本检测的阳性和阴性符合率分别为100%和90.9%。且该方法可用于只需经过简单超声处理的CaPV细胞培养样本检测,为实际样本无需提取核酸检测提供了希望。（5）基于直接PCR及CRISPR/Cas12a体系建立了D-PCR-CRISPR/Cas12a-F和D-PCR-CRISPR/Cas12a-LFB法。所建荧光法及试纸条法可检测抗EDTA牛血和组织样本中LSDV至1.67 TCID50,比没有结合CRISPR/Cas12a体系的D-PCR-LFB高3个数量级,比q PCR高2个数量级。D-PCR-CRISPR/Cas12a-F和D-PCR-CRISPR/Cas12a-LFB在检测弱阳性样本时,可有效避免假阴性出现。所建D-PCR-CRISPR/Cas12a-F和D-PCR-CRISPR/Cas12a-LFB可实现多种临床样本如组织、抗EDTA血液、血清、鼻拭子和口腔拭子中LSDV的直接检测。此外,本章利用AS-PCR并结合CRISPR/Cas12a体系筛选出三套能特异性鉴别LSDV、GTPV和SPPV的引物。（6）RPA结合CRISPR/Cas12a体系建立CaPV的一管式灵敏检测。基于此建立的荧光法及侧向流试纸条法可在50 min特异性检测CaPV至1.67 TCID50。16个盲样检测结果表明所建荧光法及侧向流试纸条法可用于CaPV实际样本检测。此外,基于LSDV疫苗株与野毒株在ORF126基因处差别,设计出了两套能够鉴别LSDV疫苗株与野毒株的引物,为LSDV的免疫监测提供了新方法。