研究背景与目的地中海贫血(thalassemia,简称地贫)是由于珠蛋白基因发生缺陷；致使珠蛋白链合成减少或缺如,使形成血红蛋白的α-链/非α-链比例失衡,而导致的一组严重威胁人类健康的致死、致残的遗传性血液病,主要发生在地中海沿岸国家、东南亚、非洲和我国南方地区,保守估计全世界地中海贫血基因携带者近2亿人,其中包括我国南方广西、广东、海南等省份。地中海贫血主要包括α-地中海贫血和p-地中海贫血,在广西、广东,α-地中海贫血基因的人群携带率分别高达17.55%、8.53%。此病目前缺乏有效治疗手段,应用相应分析技术通过人群筛查及产前诊断阻止重症患儿出生是国内外公认的首选预防措施。α-地中海贫血属于常染色体隐性遗传病,其分子基础是位于16号染色体末端16p13.3位点上的人a珠蛋白基因簇的先天性遗传缺陷。导致α-链合成减少的基因缺陷主要(>95%)是α珠蛋白基因缺失,其缺失数目是a-地中海贫血临床表现及分型的依据。在我国南方地区常见的三种α-地中海贫血缺失基因型为--SEA/αα(东南亚型)、-α3,7/aa(右缺失型)、-α4.2/αα(左缺失型)。目前对于α-地中海贫血的筛查仅停留在血液学指标,即只有明显的血液学表型的个体才会进行进一步的分子诊断,这会导致大部分的静止型携带者(如-α3.7/αα和-α4.2/αα)漏检,所以对于α-地中海贫血的筛查急需一种简单、快速基因分型的筛查手段。然而对于α-地中海贫血的分子诊断,Southern Blot杂交技术是金标准,准确性高,但操作繁琐、标本用量大、费时费力、检测通量小而不适合常规检测；目前常规的检测技术是gap-PCR技术,只能定性检测各已知缺失类型,工作量大、检测通量小,并且存在其他缺失类型的假阴性和PCR污染导致的假阳性,故仍不能满足当前大规模人群筛查及常规分子诊断的需要。本课题组发明了一种用基因拷贝数直接定量快速诊断缺失型α-地中海贫血的方法(专利号：ZL201110081598.8),该方法是采用TaqMan实时定量荧光PCR技术直接定量分析HBZ、HBA1和HBA2的相对拷贝数来诊断是否存在缺失,有效避免了由缺失类型遗传异质性导致的假阴性和外源污染导致的假阳性,且易于实现自动化与标准化,提高了检测通量和检测效率,适合缺失型a-地中海贫血大规模人群筛查和常规分子诊断。本研究是以该发明专利为技术基础,通过全基因组DNA提取的研制和PCR扩增检测体系的建立,研制出可用于临床常规检测应用的试剂盒,以满足当前临床检测的需要。研究方案与方法一个分子诊断方法,涉及到样本来源、样本制备、样本检测、结果分析等步骤,只有做好每个步骤的质量控制,才能保证结果的准确可靠,所以,基于这种完整的诊断流程,本研究具体实施了以下研究方案与方法。1.样本采集、运送及保存。不同的抗凝剂对PCR扩增的影响是不同的,例如肝素抗凝的血液标本经DNA提取后仍会影响PCR的扩增效率。血液的新鲜程度也会影响DNA提取的质量。故本研究所采用的血液标本均要求为EDTA或枸橼酸钠抗凝全血,存放在4℃冰箱不超过7天,在-20±5℃保存期为6个月；若要长期保存,需储存于-80±5℃；标本应避免反复冻融。2.全血基因组DNA提取。人类基因组DNA样本的浓度和纯度对PCR扩增都具有较大的影响,例如人类基因组DNA样本浓度太低(低于最低检测限)或含有PCR抑制剂会导致PCR扩增受到影响。因此本研究从红细胞裂解液、变性剂、消化时间、提取液和DNA溶解液等方面对DNA提取方法进行全面的研制,研制出一种能满足荧光定量PCR要求的DNA提取方法,并利用紫外分光光度计来监测DNA样本的浓度和纯度。3.试剂盒原料的质量检测。原料质量合格是一个实验成功的基本要求,所以原料的质量检测尤为重要。主要的原料包括蛋白酶K、氯化锂、引物、探针和聚合酶。蛋白酶K应为白色絮状或粉末状；氯化锂应为白色结晶粉末,分析纯；引物和探针应采用紫外分光光度计测定浓度,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定,浓度不低于合成的浓度,电泳结果应为位置正确的单一条带,表示纯度合格；聚合酶应为无色粘稠的透明液体,于-20±5℃不冻结。4.试剂盒配制与验证。试剂盒主要包括全血基因组DNA提取试剂和PCR检测试剂。全血基因组DNA提取试剂包括红细胞裂解液、DNA提取液A(缓冲液)、DNA提取液B(变性剂)、DNA提取液C(蛋白酶)、DNA提取液D、DNA溶解液。PCR检测试剂包括PCR反应液A(缓冲液,酶)和PCR反应液B(引物,探针)。所有液体配制需按照配制要求进行,配制好的液体按照相应的要求灭菌后存放或者直接存放。将配制好的全血基因组DNA提取试剂(柱提法)结合质检合格的试剂盒其它组分,以正常基因型校准品1、2、阳性参考品P1、P6、P8和阴性质控品为样本,在适用仪器上,严格按试剂盒说明书进行操作。将配制好的HBAPCR反应液A结合配制好的HBAPCR反应液B配制成PCR反应管,以正常基因型校准品1、2、最低检出量参考品L1、L2和阴性质控品为样本,在适用仪器上,严格按试剂盒说明书进行操作。试剂配制完成后,进行全套试剂的验证。全套试剂盒成品应用全套企业参考品进行检测。5.试剂盒临床试验。用缺失型α-地中海贫血基因拷贝数定量检测试剂盒和中山大学达安基因股份有限公司提供的“a-地中海贫血基因检测试剂盒(gap-PCR法)”,同时对广西区妇幼保健院、柳州市妇幼保健院和广州市妇女儿童医疗中心采集并提取获得的人类基因组DNA样本进行双盲法检测。以gap-PCR法为对照,考察PCR-荧光探针法的灵敏度、特异性、符合率等检测性能指标。对结果不符标本采用荷兰MRC-Holland公司的SALSA(?)eagents for MLPA(?) reactions(P140HBA probemix, CY5标记,BeckMan GeXP仪检测)复核检测。研究结果根据研究目标及研究策略,通过实施具体研究方案与方法,所获得的研究结果如下：1.样本采集、运送及保存。本研究所采用的血液标本均符合实验方法中的要求,即均为EDTA抗凝全血,存放在4℃冰箱未超过7天,在-20±5℃保存期为6个月；长期保存的标本,储存于-80±5℃；标本没有反复冻融。2.全血基因组DNA提取。研制了能满足本试剂盒荧光定量PCR要求的全血基因组DNA提取方法。经一系列的优化与调整,所确定的DNA提取方法需用全血200u1,用NH4Cl作为裂解液、Triton X-100作为表面活性剂、氯化锂作为提取剂和纯水作为DNA溶解液,56℃金属浴半个小时即可提取,提取过程耗时50分钟。在这种条件下,提取出的DNA浓度在20-50ng/ul之间,OD260nm/OD280mm比值在1.6～2.0之间；说明此全血基因组DNA提取方法符合本试剂盒荧光定量PCR的要求。3.试剂盒原材料的质量检测。蛋白酶K为白色絮状或粉末状；氯化锂为白色结晶粉末,分析纯；引物和探针采用紫外分光光度计测定浓度,浓度不低于合成的浓度,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定,电泳结果为位置正确的单一条带,表示纯度合格；聚合酶应为无色粘稠的透明液体,于-20±5℃不冻结。4.试剂盒的配制与验证。试剂盒各组分配制均按照要求进行,配制好的液体按照相应的要求灭菌后存放或者直接存放。配制好的试剂用质控品进行验证,定量检测结果全部正确。5.试剂盒临床试验。按照试验设计要求,以gap-PCR法为对照,共检测1449例人类基因组DNA样本,其中广西区妇幼保健院685例,柳州市妇幼保健院303例,广州市妇女儿童医疗中心461例。使用gap-PCR法和复核试剂检出阳性(缺失型a-地中海贫血)921例,阴性(排除缺失型a-地中海贫血)528例；使用荧光定量试剂盒检出阳性(缺失型α-地中海贫血)919例,阴性(排除缺失型α-地中海贫血)530例。通过统计学方法计算荧光定量试剂盒检测缺失型α-地中海贫血突变的阳性符合率99.67%、阴性符合率99.81%、粗一致性99.72%和Kappa值0.994。结论经过样本来源的控制、全血基因组DNA提取方法的研制、试剂盒原料的质量检测、试剂盒的配制与验证以及试剂盒的临床试验,本文研制的缺失型a-地中海贫血基因拷贝数定量检测试剂盒均达到临床检测试剂的要求,临床考核合格,适合缺失型α-地中海贫血的大规模人群筛查和常规诊断。