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目的:研究DEHP对MCF-7细胞中3β-HSD表达的影响,构建3β-HSD基因沉默和高表达细胞株,探索3β-HSD在DEHP生殖内分泌毒性中的作用,为进一步了解DEHP的毒性作用机制奠定基础。方法:采用浓度为0.00~0.80 mmol/L的DEHP对体外培养的MCF-7细胞分别进行染毒(12~48 h),或单一浓度0.80 mmol/L DEHP染毒不同时间(3~48 h)后,观察细胞形态学变化,检测3β-HSD在基因和蛋白表达水平的变化。应用RNA干扰技术,构建3β-HSD基因沉默载体,将3β-HSD基因沉默载体转染到MCF-7细胞中,构建3β-HSD沉默细胞株;应用分子克隆技术,构建3β-HSD基因高表达载体,将3β-HSD基因高表达载体转染到MCF-7细胞中,构建3β-HSD高表达细胞株;通过基因测序、Q-PCR和Western blot对RNA干扰效果、基因高表达效果进行鉴定。研究3β-HSD沉默或高表达对DEHP毒性的影响,体外培养构建成功的3β-HSD沉默细胞和高表达细胞,以MCF-7细胞为对照,用浓度为0.00~0.80 mmol/L的DEHP分别染毒24h,观察细胞形态学变化,检测三种细胞中MDA、SOD、GSH和GSH-PX等氧化损伤指标的变化,Q-PCR检测DNA损伤修复基因(h OGG1、h MTH1)、凋亡基因(Bax、Caspase-3、Caspase-8)和雌激素受体基因(ERα、ERβ)m RNA表达水平,Western blot检测相应蛋白的变化。开展信号通路和蛋白质组学研究,用浓度为0.00~0.40mmol/L的DEHP分别染毒三种细胞24h,检测细胞中信号通路相关基因(p38、ERK1、ERK2、i NOS、PKCα)表达水平的变化;应用信号通路抑制剂处理后再进行DEHP染毒,检测MCF-7细胞中信号通路相关基因和凋亡基因表达水平的变化;对0.40 mmol/L DEHP处理24h后的三种细胞进行定量蛋白质组学分析,筛选差异蛋白。结果:通过不同浓度DEHP分别染毒MCF-7细胞12~48 h,3β-HSD基因表达水平比对照组升高,随染毒剂量的升高而呈现上升趋势;不同剂量DEHP染毒细胞24h,3β-HSD蛋白表达水平也随着染毒剂量的升高呈上升趋势。单一浓度0.80 mmol/L DEHP染毒不同时间,3β-HSD m RNA表达水平比对照组升高,随染毒时间的延长而呈现上升趋势。基因测序验证构建的PLVX-HSD-sh RNA重组载体中的干扰序列与设计的sh RNA序列一致,基因高表达载体p LVX-HSD中的3β-HSD基因序列与Gen Bank中的序列一致;Q-PCR显示沉默细胞中3β-HSD基因表达水平较对照组MCF-7细胞降低77%,高表达细胞的3β-HSD基因表达水平比对照组细胞升高105倍;Western blot显示沉默细胞中3β-HSD蛋白表达水平较对照组MCF-7细胞降低74%,高表达细胞的3β-HSD蛋白表达水平比对照组细胞升高80%。不同浓度DEHP分别染毒三种细胞24h,随着DEHP染毒剂量的增大,MCF-7细胞中MDA含量升高,SOD活力、GSH含量及GSHPX活力显著降低,h OGG1、h MTH1、Bax、Caspase-3、Caspase-8、ERα、ERβ在基因和蛋白表达水平均高于对照组;与同一染毒剂量的MCF-7细胞比较,3β-HSD沉默细胞中MDA含量升高,SOD活力、GSH含量和GSH-PX活力显著降低,h OGG1、h MTH1、Bax、Caspase-3、Caspase-8、ERα、ERβ在基因和蛋白表达水平均降低;而3β-HSD高表达细胞中MDA含量降低,SOD活力、GSH含量、GSH-PX活力显著升高,h OGG1、h MTH1、Bax、Caspase-3、Caspase-8、ERα、ERβ在基因和蛋白表达水平均升高。DEHP染毒MCF-7细胞,p38、ERK1、ERK2、i NOS、PKCα在基因和蛋白表达水平均高于对照组;与同一染毒剂量的MCF-7细胞比较,3β-HSD沉默细胞中p38、ERK1、ERK2、i NOS、PKCαm RNA表达水平降低;而3β-HSD高表达细胞中p38、ERK1、ERK2、i NOS、PKCαm RNA表达水平升高。应用p38抑制剂处理后,DEHP染毒组p38、i NOS、Bax、Caspase-3、Caspase-8表达下调;ERK1/2抑制剂处理后,DEHP染毒组ERK1、ERK2表达下调;i NOS抑制剂处理后,DEHP染毒组i NOS、Bax、Caspase-3、Caspase-8表达下调;PKCα抑制剂处理后,DEHP染毒组PKCα表达下调。定量蛋白质组学分析,共鉴定了3342个蛋白,在DEHP处理的MCF-7细胞中,有206个蛋白上调,207个蛋白下调;在DEHP处理的3β-HSD沉默细胞中,有185个蛋白上调,197个蛋白下调;在DEHP处理的3β-HSD高表达细胞中,有217个蛋白显著上调,223个蛋白显著下调。结论:1、DEHP可引起3β-HSD在m RNA表达和蛋白表达水平的上调,在0.1~0.8 mmol/L剂量范围内存在明显的剂量-效应关系,在48 h内存在明显的时间-效应关系;其通过影响类固醇激素合成过程中的3β-羟类固醇脱氢酶表达水平而发挥生殖内分泌毒性。2、成功构建3β-HSD RNAi慢病毒载体,并筛选出3β-HSD沉默细胞株;成功构建3β-HSD基因高表达载体,并筛选出3β-HSD高表达细胞株。3、DEHP可引起MCF-7细胞发生氧化损伤,3β-HSD可能通过影响抗氧化酶的活力及DNA损伤修复过程,在DEHP氧化损伤过程中发挥抗氧化作用。4、DEHP可引起MCF-7细胞发生凋亡,3β-HSD可能通过影响凋亡基因和雌激素受体基因的表达,在DEHP致凋亡过程中起促进作用。5、DEHP引起生殖内分泌毒性可能与MAPK、NOS、PKC信号通路有关,3β-HSD对信号通路相关基因的表达有一定的调节作用,DEHP可能通过p38 MAPK/i NOS信号通路诱导细胞发生凋亡;DEHP引起的生殖毒性还可能与细胞核糖体组装、核小体组装相关。