电压门控钙离子通道(VGCCs)是位于细胞膜上的跨膜异源多聚体蛋白,至少由α1,β,αα2,δ亚基四个亚单位所组成,其中α1是介导钙离子跨膜内流、决定通道门控特性、药物和各种调节因素作用的主要功能亚基。至今已知编码门控钙离子通道а1亚基的基因有10种,根据α1亚基的门控性和生理功能的不同又将通道分为三大类,分别是Cav1、Cav2和Cav3,其中Cav1即电压门控L型钙通道,由Cav1.1、Cav1.2、Cav1.3和Cav1.4四个成员构成,Cav1.1仅在骨骼肌中表达,Cav1.4限于视网膜表达。而Cav1.2广泛表达于很多组织包括肌肉、大脑、内分泌腺、感觉器官和心脏等中都有表达,Cav1.3则主要表达于神经元、内分泌细胞和感觉器官中。最初人们只认为心脏中的LVCC仅包括Cav1.2,但后来发现Cav1.3在心脏中也有表达,并且优势表达于心房组织、窦房结和房室结中。Cav1.3基因敲除鼠(Cav1.3-/-)表现出窦性心动过缓和房室传导阻滞现象,所有这些都表明其在维持正常的心脏节律中发挥着至关重要的作用。L型钙通道的α1亚基分子量约为190～250kDa的多肽链,具有4个跨膜结构域、位于胞内的氨基酸和羧基端。已知,VGCC及其介导的Ca2+内流,在基因转录调控中发挥着重要作用。除外,近年来研究发现钙离子通道α1亚基位于胞质内的羧基端可被蛋白酶水解,其水解片段可以直接充当转录因子,在神经、肌肉等多种细胞过程中发挥调节作用。例如,Cav 1.1和Cav1.2钙离子通道,骨骼肌中Cav1.1水解下的羧基端仍以非共价键与截短的通道结合;而神经元和心肌细胞中Cav1.2水解下的羧基端(内源性的羧基端相对分子质量约为75kDa)将转运进细胞核,发挥转录因子功能。通过对比Cav1.3、Cav1.2和Cav1.1羧基端水解区域的氨基酸序列,惊奇的发现三者α1亚基羧基端有着较高的序列同源性。这提示Cav1.3钙离子通道的羧基端也会发生蛋白酶水解过程。而新近Lu等的最新报道证实了这一提示。心肌Cav1.3钙离子通道的羧基端的确存在蛋白酶水解过程,被水解的片段进入细胞核,充当转录因子调节肌球蛋白轻链(MLC2)的表达,而MLC2通过结合SK2钾离子通道,调节其膜泡运输,从而促进SK2膜表达。然而,有关Cav1.3钙离子通道羧基端的核转运现象及其病理生理意义仍有待深入研究。因此,本实验室构建了能专一性识别Cav1.3钙离子通道α1亚基羧基端2025～2140位氨基酸的羧基端抗体(C-term Ab)和α1亚基Ⅱ-Ⅲ胞质跨膜域841～910位氨基酸的氨基端抗体(N-termAb)去探究心肌细胞中Cav1.3钙离子通道α1亚基羧基端的核转运现象及其病理生理意义。主要结果如下:提取HEK293细胞和Cav1.3钙离子通道蛋白稳定表达株蛋白进行Western b1ot实验,结果显示用羧基端抗体(Anti-C-term)免疫时,可以清楚的检测到两条带,其中250KD:对应全长的Cav1.3钙离子通道蛋白大小;75KD则和内源性的羧基端片段大小一致,对应蛋白酶水解下来的羧基末端片段大小,相反氨基端的抗体也能检测到两条明显的带,分别是250kDa和175kDa,其中250kDa对应全长通道大小;175kDa对应被截掉羧基端后剩余通道的大小。分别提取心房组织总蛋白、胞质和胞核蛋白进行Western b1ot实验,结果显示羧基端在胞质和胞核中都有表达。利用免疫荧光技术,分别在稳转Cav1.3的细胞株和HL-1细胞(从小鼠心房瘤上分离下的心房肌细胞株)以及急性灌流下的小鼠心房肌细胞中研究外源性和内源性的Cav1.3羧基端的定位情况。结果显示,在这三种细胞中用羧基端抗体免疫时,除了胞质中,细胞核中也表现出明显的荧光染色,结果验证了 Cav1.3通道羧基端的水解,以及水解下的羧基端会转运进细胞核。通过分子克隆技术,将Cav1.3钙离子通道α1亚基的不同截短体构建到pEGFP-C1载体上,并在HEK293细胞中异源表达,观察羧基端的核转运现象以及其功能影响。结果显示Cav1.3钙离子通道的1901-2141位氨基酸区域对于其羧基端的核转运具有决定性作用。RT-PCR和Western b1ot结果显示羧基端的核转运具有自抑制现象,随羧基端入核量增加,Cav1.3的mRNA和蛋白表达均下调。细胞免疫荧光、RT-PCR和Western b1ot实验发现Cav1.3羧基端的核转运受到细胞内钙离子浓度和发育的调控。增加细胞内的钙离子浓度,能明显抑制Cav1.3羧基端的核转运;在整个生命周期中,细胞核中的Cav1.3羧基端表达水平相差很大,心房组织细胞核中Cav1.3钙离子通道的羧基端表达量随着小鼠的年龄进程逐渐增高,成年期达到最高,表明其羧基端的核转运受到发育的影响。分别通过Thoracic aorta constriction(TAC:主动脉缩窄手术)和ISO刺激原代心肌细胞构建心肌肥大模型,模拟心脏肥大的疾病状态,结合Western b1ot和RT-PCR研究病理状态下Cav1.3羧基端的核转运。结果显示主动脉缩窄手术后的小鼠心房组织中Cav1.3钙离子通道α1亚基羧基端在胞质中的表达量不变相反在细胞核中的表达量显著上调;同时细胞水平上,用ISO刺激的原代小鼠心肌细胞中Cav1.3钙离子通道α1亚基羧基端的核表达量也明显增加,提示肥大因素促进羧基端的核转运过程。综上所述,本研究结果表明,心肌Cav1.3钙离子通道αα1亚基的羧基端会转运进细胞核;而羧基端的核转运会受到钙离子浓度、发育和心肌肥大信号的调控;而且Cav1.3羧基端的核转运具有自抑制现象;对于羧基端从胞质到胞核的穿梭机制以及心肌肥大信号在Cav1.3羧基端的核转运中扮演怎样的角色还有待进一步的研究。