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目的本研究通过构建人巨噬细胞金属弹力酶催化域(HMEcd)基因原核表达质粒,诱导大肠杆菌表达融合6×His tag的HMEcd基因融合蛋白,经纯化、复性后用于HME体内外干预胃癌细胞实验研究。方法提取手术切除的新鲜胃癌组织总RNA,逆转录合成cDNA第一链,设计一对特异性引物PCR扩增HMEcd cDNA,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并切胶纯化后与pMD18-T载体连接,构建克隆质粒pMD18-T-HMEcd,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒,BamH I和Xho I双酶切鉴定及DNA测序正确后再将HMEcd cDNA亚克隆至pET-28a(+)载体,构建原核表达质粒pET-28a(+)-HMEcd,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒,BamH I和Xho I双酶切鉴定及DNA测序后,转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,SDS-PAGE及Western blot鉴定。His Band镍柱亲和纯化,透析重折叠复性,浓缩后测定蛋白质浓度,明胶酶谱分析及I型胶原蛋白分解实验鉴定酶活性。结果RT-PCR获得预期的HMEcd cDNA,双酶切鉴定及DNA测序证实分别成功构建克隆质粒pMD18-T-HMEcd和原核表达质粒pET-28a(+)-HMEcd,SDS-PAGE及Western blot证实在大肠杆菌中诱导表达出HMEcd基因融合蛋白,诱导5h蛋白表达量占菌体总蛋白的18.92%。纯化后SDS-PAGE分析蛋白质纯度达98%以上。重折叠复性后经活性鉴定证实HMEcd基因融合蛋白具有分解明胶及I型胶原蛋白的酶活性。结论获得HMEcd cDNA,成功构建原核表达质粒;在大肠杆菌中高效表达出HMEcd基因融合蛋白;建立融合蛋白亲和纯化及体外重折叠复性方法,成功获得高纯度活性HMEcd基因融合蛋白;为下一步HME对胃癌细胞的体内外干预研究创造了条件。