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大豆[Glycine Max（L.）Merr.]起源于中国,是一种重要的油料和高蛋白作物。盐害作为一种主要的非生物胁迫对大豆的生长发育的各个时期都有着不利的影响,并会最终导致产量和品质的降低。因此,挖掘大豆的耐盐基因并了解其耐盐的分子机制,并通过分子育种手段培育耐盐大豆是解决这一问题行之有效的方法。植物耐盐性是一种多基因调控的复杂数量性状。利用传统的全基因组关联分析（Genome-wide association studies,GW AS）容易忽视一些弱效应或者受环境影响大的位点。MAPK基因家族是植物内保守的信号通路成员,在植物生长发育,胁迫应激反应中起关键性的信号转导作用。本研究利用全基因组MAPK成员的基因家族分析,结合MAPK基因家族的关联分析,鉴定到MAPK基因家族中的耐盐相关候选基因GmMMK1并对其进行功能验证。主要的研究工作和结果如下:1.利用2019年公布的大豆基因组v4.0版本,鉴定了 32个MAPK基因家族成员。并利用多个转录组及芯片的表达谱分析MAPK家族基因在生物胁迫或非生物胁迫中的诱导表达模式。结果如下:MAPK家族基因位于除3、10、16、19和20号染色体外的所有染色体中。大豆MAPK与拟南芥和水稻中的MAPK家族相似,可以将其分为4个不同的亚组。氨基酸序列比对表明,大豆MAPK家族基因由三种基因结构域组成:TEY MAPK结构域,TDY MAPK结构域或PK结构域。为了确定大豆MAPK家族基因能否响应外界环境胁迫,本研究从公共数据库中收集了多种环境胁迫下的大豆MAPK家族基因表达谱,包括盐胁迫、碱胁迫、脱水胁迫、铝胁迫、斜纹夜蛾饲喂、大豆蚜虫侵染、大豆疫霉菌感染,和锈病感染。大豆MAPK家族基因对更多对非生物胁迫,尤其是对各浓度的盐胁迫作出积极响应。此外,基于转录组数据的组织表达分析结果显示,在所有组织中,根和根瘤中的MAPK基因的表达丰度最高。2.萌发期是大豆第一个生育时期,且发芽率与耐盐性高度相关。本试验调查了两个环境下由219份材料组成的大豆自然群体的发芽情况,并进行了基因家族基因的关联分析,结果如下:自然群体的发芽率基本呈正态分布,结合219份材料的全基因组重测序数据产生的31个大豆MAPK家族基因的1202个SNP进行MAPK基因家族关联分析。结果显示GmMMK1（Glyma.18G236800）上有一个明显的峰,最高-logP达到6.52。对候选基因GmMMK1使用压缩混合线性模型（Compressed Linear Mixed Model,cMLM）模型进一步分析,并计算了其中93个多态性位点的连锁不平衡（LD）。得到的显著位点集中在非编码区,特别是启动子区。基于显著的7个SNP和1个InDel,可以将219份大豆材料中209份材料分为4种主要单倍型。单倍型差异主要集中于3个连锁位点,导致了 Hap 1和Hap3的ST-GR（盐处理比水处理下的相对发芽率）明显高于Hap2和Hap4。进一步分析不同单倍型的诱导表达模式,我们发现在萌发期和苗期,启动子类型不同的Hap1和Hap2材料在盐处理后的表达模式正好相反。使用PlantPAN数据库进一步对启动子进行分析,我们发现,GmMMK1与WRKY等转录因子存在调控关系。值得注意的是,ABA相关基因GmAREB3的Chip-Seq试验验证了其与GmMMK1的启动子可能存在结合关系。3.构建pMDC83-GmMMK1重组载体转化大豆毛状根和拟南芥并进行表型鉴定,结果如下:在0mMNaCl存在下,转基因毛状根与其对照之间没有发现明显差异。暴露于75 mMNaCl后,与对照植物相比,GmMMK1-OE嵌合体植株叶片失绿,平均叶绿素含量降低,平均根鲜重降低,根系的根长、侧根数也明显下降。同时,GmMMK1-OE毛状根中的平均Na+含量明显高于对照。这些结果表明,GmMMK1-OE嵌合体比对照表现出更强的盐敏感性。除此之外,在150 mMNaCl中处理2天后,GmMMK1-OE植物表现出明显的盐害症状,出现萎蔫,叶片发白,濒临死亡。与转基因嵌合体相比,对照大豆则表现出相对更强的盐耐受性。由于使用萌发期发芽率作为表型鉴定得到GmMMK1,所以进一步使用35S::GmMMK1转化拟南芥观察异源表达后的发芽率。在没有盐胁迫的时候,转GmMMK1拟南芥株系表现出与WT相同的发芽率,而在不同梯度浓度盐处理之后,转基因拟南芥发芽率下降相比对照株系更加明显。4.为鉴定GmMMK1与耐盐相关的遗传调控网络,进行了转录组与酵母双杂交试验筛选互作基因,结果如下:获取盐处理下GmMMK1转基因嵌合体毛状根与其空载对照毛状根,进行转录组测序。盐处理下,过表达GmMMK1导致多种应激基因的转录水平改变,其中响应氧化胁迫相关基因表达量下降且被富集。差异表达基因的KEGG通路分析显示MAPK级联信号通路被富集,通路中PYL相关基因与PP2Cs基因是ABA核心信号转导的重要组成。在蛋白水平,GmMMK1的亚细胞定位表明GmMMK1位于质膜和细胞核。通过酵母双杂交筛选大豆根cDNA文库,获得了 23个互作蛋白,包括ABA受体蛋白GmPYL4,并于BiFC（双分子荧光互补试验）中验证GmMMK1与GmPYL4的互作发生在质膜上。为进一步验证GmMMK1与ABA在环境胁迫下对植株表型的影响,将转基因拟南芥幼苗转移到含有ABA或NaCl的垂直培养基中,发现转基因拟南芥受到更加明显的抑制。结合GmMMK1的启动子分析、过表达材料的转录组分析、酵母双杂交实验,结果表明GmMMK1参与ABA信号传导并影响盐胁迫下的大豆根系生长而影响耐盐性。