β地中海贫血的分子病理是由于β珠蛋白基因发生突变,导致β珠蛋白链的合成不足或完全不能合成,引起α与非α珠蛋白链的合成比例不平衡,影响正常血红蛋白的合成;此外,由于α珠蛋白链的相对过剩,剩余的α珠蛋白链在红细胞内形成包涵体,导致红细胞膜的氧化损伤,造成红细胞破坏及骨髓的无效造血。目前β地中海贫血的基因治疗大多停留在β珠蛋白工程上。有研究认为,适当下调内源性α珠蛋白基因表达,减少α珠蛋白肽链合成,可能比增加β珠蛋白肽链生成更有助于改善β地贫患者症状。RNA干扰是近年来新发现的一种重要的基因表达调控方式,它是由内源产生或人为转染进入细胞的小干扰RNA(siRNA)诱导产生的一种转录后基因沉默现象。由于能够下调靶基因的表达,RNA干扰已经广泛应用于基因功能研究及抗病毒感染等领域,并为基因治疗开辟了全新的途径。本研究探讨靶向α珠蛋白基因的siRNA对重型β地中海贫血α珠蛋白的调控作用。研究分为二个部分。第一部分,通过脂质体转染siRNA作用于体外培养的正常人的红系细胞,筛选获得有效抑制α珠蛋白基因表达的siRNA及最佳作用浓度。第二部分,观察脂质体转染siRNA对体外培养重型β地中海贫血红系细胞α-珠蛋白的调控作用。本研究侧重于在分子水平调控β地中海贫血红系细胞α珠蛋白的合成,改善红系细胞内珠蛋白比例的失衡,探讨RNA干扰治疗β地中海贫血的新思路。第一部分siRNA对体外培养红系细胞α-珠蛋白基因表达的影响目的研究针对α-珠蛋白基因的小分子干扰RNA(siRNA)对体外培养红系细胞α-珠蛋白肽链mRNA表达的影响。方法将针对α-珠蛋白肽链设计、化学方法合成的3条siRNA通过脂质体转染体外培养正常人的红系细胞,在转染后24h、48h、72h,用流式细胞术检测转染效率,实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测a链mRNA表达水平,分别筛选有效抑制a-珠蛋白肽链表达的siRNA及最佳作用浓度。结果1.脂质体对培养的红系细胞有较高的转染效率。脂质体转染FCM标记的siRNA进入红系细胞后,24h、48h、72h的转染效率分别为61.2%,44.3%,33.7%,转染效果以24h最高,随时间延长转染效率降低。2.筛选获得有效抑制a-珠蛋白基因表达的siRNA。由设计软件设计合成3条针对a-珠蛋白基因的siRNA,作用于体外培养的红系细胞,经实时定量RT-PCR检测,3条siRNA均有下调a-珠蛋白基因表达的效应,以α2siRNA的抑制效应最高,转染后24h、48h、72hα-珠蛋白基因mRNA相对表达量分别为0.56±0.02、0.41±0.02、0.40±0.02,其中24h与48h、72h之间差异有统计学意义(P＜0.05),但48h、72h之间无差异(P＞0.05)。3.siRNA对a-珠蛋白基因表达的抑制效应在一定范围内具有浓度及时间依赖特性。浓度越大,抑制效应越高。不同浓度siRNA的α-珠蛋白基因相对表达量之间相互比较:120 nmol/L、160 nmol/L、200nmol/L组相对表达量低于40nmol/L与80nmol/L(P＜0.05),80 nmol/L与40nmol/L之间,200 nmol/L、160 nmol/L、120 nmol/L之间,差异无统计学意义(P均＞0.05)。各时间的α-珠蛋白基因相对表达量之间相互比较:200nmol/L、160 nmol/L、120 nmol/L三组的相对表达量在48h与72h低于24h(P＜0.05),但48h与72h之间,其差异无统计学意义(P＞0.05)。4.不同浓度siRNA作用后,红系细胞台盼兰拒染率的差异具有统计学意义(P＜0.05),浓度越高,台盼兰拒染率越低,且作用时间越长,台盼兰拒染率也越低。结论通过脂质体将α链特异的siRNA转染体外培养的红系细胞后,可在转染后48h有效下调α链mRNA的表达水平,抑制效应最佳的是α2 siRNA,最佳作用浓度为120 nmol/L。第二部分siRNA对体外培养重型β地中海贫血红系细胞α-珠蛋白的调控作用目的研究脂质体转染siRNA对体外培养重型β地中海贫血红系细胞α-珠蛋白的调控作用,探讨应用siRNA进行β地中海贫血基因治疗的可能性。方法应用实时定量RT-PCR检测正常人及重型β地贫患者的α、β、γ珠蛋白基因mRNA的表达,了解α、β、γ珠蛋白基因之间的比例。脂质体介导靶向α-珠蛋白基因表达的α2 siRNA以120nmol/L浓度作用于体外培养的重型β地贫红系细胞,设置空白对照组。在转染后48h,实时定量RT-PCR分析siRNA组和对照组中红系细胞的α、β、γ珠蛋白基因mRNA的表达情况,观察siRNA对相应珠蛋白基因表达的影响。此外,通过HPLC检测siRNA作用96h后血红蛋白水平,透射电镜观察siRNA作用前后红系细胞内α-珠蛋白肽链沉积情况,了解siRNA对β地贫红系细胞内过剩α-珠蛋白肽链的影响。结果1.与正常人比较,重型β地贫患者α/β及γ/β+γ的比例明显失衡。a/β比值在正常人和患者中分别为1.18±0.22和31.7±3.45(P＜0.01),γ/β+γ比值在正常人和患者中分别为0.06±0.01和0.93±0.05(P＜0.01)。2.脂质体转染的α2 siRNA能部分抑制体外培养的重型β地贫红系细胞中α-珠蛋白基因表达。实时定量RT-PCR结果显示a2 siRNA作用后α-珠蛋白基因相对表达量在空白对照组和siRNA组分别为0.85±0.03和0.56±0.04(P＜0.01),同时,siRNA改善了α/β和α/β+γ比例失衡,α/β比值在空白对照组和siRNA组分别为15.9±1.71和10.5±0.98(P＜0.01),α/β+γ比值在空白对照组和siRNA组分别为2.31±0.08和1.34±0.04(P＜0.01)。3.HPLC定量检测表明siRNA作用后HbA和HbF均有所增高。随着siRNA下调α-珠蛋白基因表达后,培养的重型β地贫红系细胞中HbA在空白对照组和siRNA组分别为49.21±3.89和54.46±4.12(P＞0.05),HbF在空白对照组和siRNA组分别为30.75±2.63和33.67±3.92(P＞0.05)。4.透射电镜结果证实siRNA作用后重型β地贫红系细胞内过剩的a-珠蛋白肽链沉积有所减少,特别是在早期幼红细胞中。结论脂质体转染α2 siRNA能部分抑制体外培养的重型β地贫红系细胞中α-珠蛋白基因表达,从分子水平改善了α/β、α/β+γ的比例失衡,减少了红细胞内过剩α-珠蛋白肽链沉积。理论上,siRNA可能有助于减轻过剩α-珠蛋白肽链沉积所致红细胞破坏,延长红细胞寿命,减少溶血,改善重型β地贫的症状。