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弧菌Ⅲ型系统效应蛋白对宿主细胞具有致病功能,研究效应蛋白的结构功能对研究其致病机理和制作疫苗有重要意义。根据Gen Bank上面溶藻弧菌的基因序列,设计hop Pma J、va1686和type3hy322 3对效应蛋白基因的引物,PCR扩增获得三个基因的全长片段。结果显示:hop Pma J全长345bp,共编码114个氨基酸残基,生物信息学分析表明其不存在信号肽,有蛋白激酶磷酸化等位点,三级结构预测模型为同源二聚体。克隆和测序分析了va1686和type3hy322基因,va1686全长为1164bp,为溶藻弧菌效应蛋白中的膜通透蛋白基因;type3hy322全长为969bp,为溶藻弧菌效应蛋白中的转运蛋白基因。在大肠杆菌表达type3hy322和va1686,得到Type3hy322和Va1686蛋白。通过对溶藻弧菌HY9901 hop Pma J基因的PCR扩增、融合,酶切、连接、转化、菌株接合、同源重组和缺失株筛选,成功能构建缺失株Δhop Pma J,并对Δhop Pma J的生物学表型特征进行了研究,确定突变株具有遗传稳定性。野生株V.alginolyticus HY9901和Δhop Pma J比较,两者生长速率一致,Hop Pma J生物被膜形成能力,胞外蛋白酶活性没有显著变化,Δhop Pma J泳动能力显著减低。Δhop Pma J对斑马鱼的其半致死量LD50为1.2×108cfu/m L,比野生株下降约有两个数量级。对Δhop Pma J在鱼体中的生物安全性及其免疫保护性进行了研究。用106cfu/m L浸泡组30min,28d后,用野生株进行攻毒,免疫保护率为35%,与对照组相比没有显著差异(R≥0.5,p≥0.05)。以105cfu/m LΔhop Pma J注射免疫斑马鱼,28d后,用108 cfu/m L野生株攻毒,免疫保护率为75%,与对照组相比差异显著(R≤0.5,p≤0.05)。提示Hop Pma J减毒后,对宿主的免疫性有良好启动和促进作用。