甜菜黑色焦枯病毒(beet black scorch virus,BBSV)能够系统侵染本生烟,当与其卫星RNA共同侵染时,BBSV系统侵染本生烟能力增强,尤其在较低温度(18℃)下导致的病毒侵染症状明显加重。卫星RNA促进BBSV侵染本生烟的作用机制尚无报道。本论文利用芯片杂交和RNA测序两种高通量研究方法,对BBSV及其卫星RNA侵染后的本生烟进行转录谱分析,希望借以研究卫星RNA促进病毒侵染、加重植株发病症状的机制,为深入了解病毒侵染寄主植物后的致病过程和致病机理提供基础。本文利用芯片杂交和RNA测序两种方法对BBSV及其卫星RNA接种后侵染早期的本生烟叶片进行了转录谱分析。其中,在基因芯片实验中,以未接种病毒的健康植物为对照,比较了 BBSV侵染、或BBSV与卫星RNA共同侵染本生烟,以及在侵染后不同时间寄主植物基因的表达情况,共获得4503个差异表达的基因。这些被激活的基因除了分布在与生物合成有关的核糖体(Ribosome)、蛋白酶体(Proteasome)、光合作用(Photosynthesis)等重要通路中,尤其值得关注的是一些与植物激素合成(Biosynthesis of plant hormones)或植物-病毒相互作用(Plant-pathogen interaction)等通路相关的基因表达量迅速上调,而卫星RNA的加入则使得这种上调变化减弱。为了弥补基因芯片无法检测未知基因的局限和不足,进一步采用了高通量RNA测序技术对差异表达基因进行检测,以挖掘更多的可能参与抵抗BBSV侵染过程的植物基因。RNA测序分析结果与芯片杂交结果一致,即病毒侵染后植物体内各种抗性基因及通路响应显著,卫星RNA的加入对本生烟内因BBSV侵染而产生的基因差异表达具有抑制作用。进一步将BBSV与卫星RNA共同侵染的样品与BBSV单独侵染的本生烟样品进行比较分析,结果表明卫星RNA加重侵染症状可能与基因沉默(3个差异表达基因)、植物抗性基因(35个差异表达基因)、转录因子(47个差异表达基因)、受体蛋白(49个差异表达基因)、泛素化(34个差异表达基因)、生长素(17个差异表达基因)等相关途径基因表达变化相关,BBSV侵染引起这些基因的差异表达因卫星RNA加入而受到抑制,从而减弱了本生烟对BBSV侵染的抗病响应。为了深入了解卫星RNA在以上过程中的作用,对植物基因沉默通路相关基因又进行了分析验证。结果表明,BBSV侵染本生烟后,基因沉默通路中关键功能基因RDR6(RNA-directed RNA polymerase 6)、DCL2(Dicer-like protein 2)、AGO1(argonaute protein 1)、AGO2(argonaute protein 2)表达量上调,推断本生烟可能是通过上调这些基因的表达量以提高基因沉默效率从而增强植物抗病毒能力。与BBSV单独侵染相比,卫星RNA的加入抑制了AGO2表达量的上调,由此推测卫星RNA可能通过降低沉默通路关键基因的表达水平来降低植物抗性。另外,与未接种的健康植物相比,在AGO2表达量上调的同时,检测到miR403表达量下调,鉴于AGO2是miR403的靶标蛋白,miR403可以介导AGO1对AG02的降解,所以推测BBSV的侵染可能通过抑制miR403的表达来上调AGO2的表达量。然而,与BBSV单独侵染相比,卫星RNA的加入使AGO2的积累量下降,但miR403积累量也同时表现为更大程度的下降,说明卫星RNA加入后植物对AGO2的调控还存在其他途径。为了获得较高可信度的转录谱分析结果,本论文还进行了适用于病毒侵染本生烟实时荧光定量PCR(qPCR)分析的内参基因筛选工作。根据芯片数据中BBSV侵染后本生烟内稳定表达的基因和文献报道中常用的内参基因信息,选取了 26个候选基因,通过qPCR检测发病叶片中候选内参基因的表达量,经过geNorm、NormFinder和BestKeeper三个软件分析,最终确定NbUP7和GBP为烟草坏死病毒A(TNV-A)、甜菜黑色焦枯病毒(BBSV)、甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)、大麦条纹花叶病毒(BSMV)和马铃薯X病毒(PVX)五种病毒侵染本生烟后相对表达最稳定的内参基因,可以用于qPCR分析。综上所述,卫星RNA可能通过抑制本生烟内相关通路因BBSV侵染而产生的基因差异表达,从而减弱本生烟对病毒的抗病响应,降低本生烟防御BBSV的能力,导致病毒侵染本生烟的发病症状加重。