背景和目的:结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是最常见的消化系统恶性肿瘤,发病率高、预后差,且其发病率在全球范围内呈上升趋势。近年来,尽管医疗技术的进步和多学科综合治疗方案的实施,在转移性结直肠癌的治疗方面取得了很大的进展,但转移性结直肠癌的死亡率仍然居高不。导致结直肠癌患者死亡的主要原因是结直肠癌发生转移。上皮-间充质转化（EMT）被认为是肿瘤侵袭和转移早期的关键事件,肿瘤血管生成也对肿瘤的生长和转移至关重要。SERPINB5（Serpin family B member 5）是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族中的一个非抑制性成员,具有多种生物学活性,包括调节细胞粘附,迁移,凋亡,控制基因表达和氧化应激反应。根据先前的研究,SERPINB5可能与血管生成和EMT有关。因此,研究SERPINB5在EMT过程和血管生成中的作用,揭示导致结直肠癌侵袭和转移的潜在机制,为结直肠癌患者的治疗提供新的思路和分子靶标,有助于提高临床疗效和改善预后。我们在前期研究中,发现SERPINB5基因在结直肠癌中异常高表达。然而,SERPINB5是否参与结直肠癌的肿瘤血管生成、EMT过程和结直肠癌侵袭转移尚不明确。本课题中,我们首先通过生物信息学分析SERPINB5在泛癌中的表达及诊断价值,然后利用分子生物学实验检测SERPINB5在结直肠癌中的表达,通过一系列实验探索SERPINB5在肿瘤血管生成、EMT和结直肠癌侵袭转移中的作用及机制。材料与方法:（一）SERPINB5在人结直肠癌中的表达及预后分析1.生物信息学分析SERPINB5在TCGA泛癌中的表达规律,评估SERPINB5在泛癌中的诊断能力。2.从TCGA数据库信息中提取结直肠癌患者的基因表达数据和临床数据,分析SERPINB5在结直肠癌和正常结肠黏膜组中的表达差异,并分析SERPINB5与结直肠癌临床病理参数及预后的关系。进一步利用Progno Scan数据库分析SERPINB5在结直肠癌中的预后意义。3.收集结直肠癌及癌旁组织标本,利用免疫组织化学方法检测SERPINB5在结直肠癌及癌旁的表达。（二）SERPINB5对人结直肠癌细胞生物学行为的影响1.Western blot检测常见人结直肠癌细胞系中SERPINB5的表达。2.构建SERPINB5基因过表达及敲低的结直肠癌稳转细胞株。3.利用MTT、克隆形成、划痕愈合、Transwell等实验分析增加/降低SERPINB5的表达对结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响。（三）SERPINB5在结直肠癌中对血管生成的影响1.利用TCGA数据库中结直肠癌患者的基因测序数据,使用GSEA分析SERPINB5与血管形成通路的相关性。2.免疫组化检测CD31在结直肠癌中的表达,并计算微血管密度;免疫荧光方法检测结直肠癌组织标本中SERPINB5与CD31蛋白的表达水平,分析SERPINB5与CD31的相关性。3.制备过表达和敲低SERPINB5的结直肠癌细胞株的条件培养基,检测条件培养基对人脐静脉内皮细胞株（HUVEC）小管形成及侵袭能力的影响,分析SERPINB5在体外对肿瘤血管生成的影响。4.构建稳定过表达SERPINB5的人脐静脉细胞株（HUVEC）,利用小管形成及Transwell侵袭实验检测SERPINB5的过表达对HUVEC小管形成及侵袭能力的影响。（四）SERPINB5通过TNF-α/NF-κB信号通路调控人结直肠癌的侵袭转移1.利用TCGA数据库中结直肠癌患者的基因表达数据,通过GSEA基因富集的方法分析结直肠癌中与SERPINB5高表达相关的信号通路。2.通过免疫荧光技术分析SERPINB5与TNF-α的相关性;免疫共沉淀（Co-IP）方法检测SERPINB5与TNF-α的相互作用。3.Western blot检测过表达或敲低SERPINB5对结直肠癌细胞EMT和血管形成相关蛋白的影响;Western blot检测过表达SERPINB5对HUVEC血管形成相关蛋白的影响。4.Western blot检测QNZ（TNF-α/NF-κB抑制剂）对TNF-α/NF-κB信号通路、EMT相关蛋白和促血管形成相关蛋白表达水平的影响。5.利用细胞划痕实验和Transwell侵袭实验检测QNZ对结直肠癌细胞迁移和侵袭功能的回复作用。结果:（一）SERPINB5在人结直肠癌中的表达及预后分析1.TCGA泛癌非配对样本数据分析表明SERPINB5在13种肿瘤中高表达;TCGA泛癌配对样本数据分析表明SERPINB5在10种肿瘤中高表达。2.SERPINB5在8种肿瘤中的AUC大于0.9,在14种肿瘤中的AUC在0.7-0.9之间,在6种肿瘤中的AUC在0.5-0.7之间。3.SERPINB5在结直肠癌组织中的表达明显高于癌旁正常结直肠粘膜组织;SERPINB5高表达与结直肠癌的N分期、CEA水平和淋巴管浸润呈正相关,与无进展生存期呈负相关,并且SERPINB5是结直肠癌无进展生存期的独立预测因素。（二）SERPINB5对人结直肠癌细胞生物学功能的影响1.增加SERPINB5表达促进结直肠癌细胞的增殖功能,敲低SERPINB5抑制结直肠癌细胞的增殖功能。2.增加SERPINB5表达促进结直肠癌细胞的迁移,敲低SERPINB5抑制结直肠癌细胞的迁移。3.增加SERPINB5表达促进结直肠癌细胞的侵袭,敲低SERPINB5抑制结直肠癌细胞的侵袭。（三）SERPINB5在结直肠癌中对血管生成的影响1.过表达SERPINB5的结直肠癌细胞条件培养基能促进HUVEC的小管形成及侵袭能力。2.敲低SERPINB5的结直肠癌细胞条件培养基抑制HUVEC的小管形成及侵袭能力。3.在HUVEC中,SERPINB5过表达反而抑制小管形成及侵袭能力。（四）SERPINB5通过TNF-α/NF-κB信号通路调控人结直肠癌的侵袭转移1.通过GSEA分析发现,SERPINB5高表达与TNF-α/NF-κB信号通路和EMT基因集相关;进一步的相关性分析发现,SERPINB5与TNF-α/NF-κB信号通路和EMT基因集的关键蛋白呈正相关性。2.SERPINB5能够调控EMT相关蛋白的表达:过表达SERPINB5能够显著下调E-cadherin的蛋白表达水平,同时上调N-cadherin、MMP2和MMP9的蛋白表达水平;相反地,敲低SERPINB5能够上调E-cadherin的蛋白表达水平,同时下调N-cadherin、MMP2和MMP9的蛋白表达水平。3.SERPINB5可以调节血管生成相关因子:过表达SERPINB5的结直肠癌细胞中,HIF-1α、COX-2和VEGFA蛋白表达水平升高;敲低SERPINB5的结直肠癌细胞中,HIF-1α、COX-2和VEGFA蛋白表达水平降低。在过表达SERPINB5的人脐静脉内皮细胞中,HIF-1α、COX-2和VEGFA水平反而下降。4.SERPINB5通过TNF-α/NF-κB信号通路促进结直肠癌细胞的EMT、血管形成、迁移和侵袭:我们通过免疫荧光实验发现SERPINB5与TNF-α在结直肠癌组织中的表达存在共定位,且表达水平呈正相关性;免疫共沉淀证实SERPINB5与TNF-α存在相互作用。Western blot检测改变SERPINB5的表达后对TNF-α/NF-κB通路关键分子（TNF-α,NF-κB p65和p-NF-κB p65）表达的影响。Western blot结果发现:过表达SERPINB5能够显著上调TNF-α和p-NF-κB p65的表达水平,NF-κB p65的表达水平不变;相反地,敲低SERPINB5能够下调p-NF-κB p65的表达水平,而NF-κB p65的表达水平不变。在过表达SERPINB5的结直肠癌细胞中加入QNZ抑制TNF-α/NF-κB通路的激活,EMT相关蛋白（E-cadherin、N-cadherin、MMP2和MMP9）和促血管生成相关因子（HIF-1α、COX-2和VEGFA）的变化均被逆转,并且QNZ可以逆转SERPINB5过表达的结直肠癌细胞的迁移和侵袭功能。结论:1.SERPINB5在结直肠癌组织中的表达显著上调,且与结直肠癌患者无进展生存期呈负相关性。2.SERPINB5可能通过促进结直肠癌细胞分泌促血管生成因子,从而促进血管生成。3.SERPINB5通过激活TNF-α/NF-κB信号通路,促进结直肠癌发生EMT及血管生成,从而促进结直肠癌的侵袭转移。