昆虫属于变温动物,其生长、发育等一系列生命活动的进行均受到周围环境条件的制约。极端的低温、干旱以及食物供应减少等不利的生长环境严重地限制了昆虫的生命活动。昆虫在对周围环境条件的不断感知与适应的过程中,渐渐地进化出了滞育特性。滞育是指生物有机体发育到某一阶段,其生长和发育暂时停滞以应对不利生活环境的一种生理现象。滞育可以通过生物的外部形态、生活习性和内部生理等变化进行鉴定。家蚕不仅是一种重要的经济昆虫和鳞翅目模式生物,同时也是卵期（胚胎期）进入滞育的典型昆虫,其滞育的发生与其经济性状直接相关。目前,家蚕胚胎滞育的研究主要集中在滞育激素以及温度、光照等环境信号对家蚕母代滞育的影响,而有关家蚕子代滞育的研究报道相对较少,同时,决定家蚕胚胎滞育的遗传基础也尚未得到明确解析。因此,开展家蚕滞育分子机制的研究对于昆虫滞育理论的补充、经济昆虫的保护和利用以及农林害虫的生物防治都具有重大意义。家蚕着色非滞育卵突变体pnd（pigmented and non-diapausing）是由位于家蚕第11号染色体上的单基因引起的隐性突变,其纯合体胚胎表现为着色非滞育,而杂合体胚胎则表现为着色滞育。同时,pnd突变体卵的滞育特性只由子代的基因型决定,而与母代滞育激素是否分泌以及母代所感知的环境条件无关。因此,pnd突变体作为鉴定家蚕受精后决定当代滞育的遗传因子的优势材料,为开展家蚕子代滞育的研究以及解析决定家蚕胚胎滞育的遗传基础提供了可能。本研究中通过对pnd突变体进行生理生化分析,利用基因组三代测序数据得到了pnd突变体的候选基因,并结合分子克隆、基因表达量差异分析以及双荧光素酶报告系统检测等方法确定了pnd突变体的控制基因,后期通过对pnd基因的功能研究及其分子机制探究,为研究家蚕胚胎滞育的调控机制奠定了基础。本研究的主要结果如下:1.家蚕pnd突变体的生理生化分析通过ELISA技术对pnd/pnd纯合体、pnd/+pnd杂合体和+pnd/+pnd野生型雌性个体在蛹期三天的血液中滞育激素（DH）含量进行测定,发现pnd/pnd纯合体、pnd/+pnd杂合体和+pnd/+pnd野生型雌性个体在蛹三天的血液中DH含量没有显著差异,这表明pnd位点对滞育的决定作用发生在子代受精之后,而并非受到母代滞育激素释放的影响。将pnd/pnd纯合体、pnd/+pnd杂合体以及+pnd/+pnd野生型蚕卵同时置于25℃,12h光照/12小时黑暗条件下,催青8天后观察到88%的pnd/pnd纯合体蚕卵出现转青,其余12%的pnd/pnd纯合体蚕卵也已经出现点青且其颜色有所加深;而对于同样条件下催青的pnd/+pnd杂合体以及+pnd/+pnd野生型蚕卵则处于深度滞育状态。催青9天后发现pnd/pnd纯合体蚕卵已经全部出蚁,而pnd/+pnd杂合体以及+pnd/+pnd野生型蚕卵则继续维持在深度滞育状态,这与先前报道的pnd突变体的表型一致。同时,我们分别对36h、48h、72h的pnd/pnd纯合体蚕卵、pnd/+pnd杂合体以及+pnd/+pnd野生型蚕卵进行解剖,发现pnd/+pnd杂合体胚胎和+pnd/+pnd野生型胚胎停滞在48h左右,而pnd/pnd纯合体胚胎则一直发育。2.基因组测序数据分析我们采用三代基因组测序技术,分别对pnd/pnd纯合体、pnd/+pnd杂合体基因组进行三代基因组测序,以大造基因组序列数据作为参考,通过使用基因组可视化软件Savant Genome Browser 2.0对基因组三代测序数据进行可视化分析,发现在pnd/pnd纯合体基因组11号染色体上KWMTBOMO06872基因区域以及该基因的基因间区存在基因组结构性变异（Structural variation,SV）。3.Bmtret1基因的分子克隆及表达差异分析KWMTBOMO06872基因在家蚕基因组数据库Silk Base上的基因注释为Bmtret1-like,结合果蝇基因组数据库Fly Base和NCBI等进行序列比对分析发现,其同源基因为海藻糖转运体Bmtret1,将Bmtret1作为pnd突变体的候选基因。通过q RT-PCR调查了Bmtret1在pnd/pnd纯合体、pnd/+pnd杂合体和+pnd/+pnd野生型中的表达模式,发现该基因于6h、12h和18h在pnd/+pnd杂合体和+pnd/+pnd野生型中的表达水平显著高于pnd/pnd纯合体。同时,我们分别在pnd/pnd纯合体、pnd/+pnd杂合体和+pnd/+pnd野生型中对Bmtret1进行分子克隆并对克隆序列进行分析,发现该基因在pnd/pnd纯合体基因组中存在747bp核苷酸序列缺失现象,其中包括Bmtret1基因的3′UTR缺失355bp、基因间区缺失392bp。我们进一步在多个家蚕品系中对该基因的序列进行克隆分析,发现Bmtret1基因的3′UTR缺失355bp、基因间区缺失392bp的现象在pnd/pnd纯合体基因组中特异存在。我们利用双荧光素酶系统实验对Bmtret1基因的差异位点进行验证,发现Bmtret1基因的3′UTR缺失355bp导致该基因的m RNA水平显著下调。4.Bmtret1基因的生物信息学分析对Bmtret1基因进行生物信息学分析,显示该基因开放阅读框（ORF）全长为1584bp,共编码527个氨基酸,Bmtret1基因属于主要协助转运蛋白超家族（Major facilitator superfamily,MFS）成员,Bmtret1蛋白共含有12个跨膜结构域。对多个鳞翅目昆虫基因组中Tret1及其两侧基因的共线性进行分析,发现古代泛素蛋白1（Ancient Ubiquitous Proein1,AUP1）基因、粘脂蛋白3（Mucolipin3）基因、Tret1基因、TBC1结构域家族14（TBC1 domain family14,TBC1D14）基因、视黄醇脱氢酶11（Retinol dehydrogenase11,RDH11）基因具有保守的线性排布,说明Bmtret1在鳞翅目昆虫中极其保守。5.Bmtret1基因的功能研究为了探究Bmtret1基因在家蚕胚胎滞育决定过程中的作用,我们采用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术在野生型家蚕品系大造（Dazao）中对Bmtret1基因进行敲除。通过体外转录合成Bmtret1基因的两个特异的sg RNA,并与Cas9蛋白混合后,将其显微注射于低温（15℃）催青大造刚产的蚕卵中,注射后G0代蚕卵在25℃催青,在G1代本应该全部滞育的蚕卵中获得了和pnd/pnd纯合体相同的突变表型,即蚕卵表现为着色非滞育。因此,我们将Bmtret1基因确定为pnd突变体的控制基因。同时,我们对非滞育个体进行Bmtret1基因序列测序,发现在该基因的sg RNA靶点附近存在4种序列编辑现象且均致使Bmtret1基因发生移码突变,使其功能丧失,从而达到对Bmtret1基因功能的敲除。结果表明,Bmtret1基因对家蚕胚胎滞育的调控是必需的。6.Bmtret1基因调控pnd突变体形成的作用机制研究为了进一步研究Bmtret1基因调控pnd突变形成的分子机制,我们分别测定了pnd/pnd纯合体、pnd/+pnd杂合体和+pnd/+pnd野生型6h、12h、18h和24h子代海藻糖和糖原含量,发现pnd/+pnd杂合体及+pnd/+pnd野生型18h和24h子代海藻糖和糖原的含量都显著高于pnd/pnd纯合体,暗示Bmtret1基因调控pnd突变的形成可能是由于pnd/pnd纯合体、pnd/+pnd杂合体和+pnd/+pnd野生型中该基因表达量的不同致使海藻糖的转运出现差异,从而限制了海藻糖向糖原的转化,造成pnd/pnd纯合体胚胎着色非滞育,而pnd/+pnd杂合体和+pnd/+pnd野生型胚胎表现为着色滞育的表型。综上所述,海藻糖转运体Bmtret1基因的突变导致了家蚕着色非滞育卵突变体pnd的表型,Bmtret1基因可能在特异性转运海藻糖以及促进海藻糖转化为糖原从而为pnd突变体胚胎的发育提供能量的过程中发挥了重要作用。