糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病的独立并发症,心肌纤维化是其致病因素之一。心肌纤维化伴随着心脏间质胶原网络的重构和心脏功能的减退,可致心肌僵硬度增加、心律失常、心室舒张功能减退、冠状动脉血流储备下降,甚至引起猝死。高血糖是心肌纤维化发病的重要诱因。中医上认为糖尿病属于“消渴”的范畴,阴虚燥热炽盛是其病因,血瘀贯穿整个发病过程。益气养阴,活血化瘀是糖尿病心肌病的基本治法。Wnt通路的异常激活可能是心肌纤维化的发病原因之一,本课题拟从Wnt通路的变化探讨活血化瘀方有效成分抗心肌纤维化的作用机理。第一部分高糖诱导心肌成纤维细胞增殖模型的建立通过改进差速贴壁法,成功培养乳鼠心肌成纤维细胞。成功建立高糖诱导成纤维细胞增殖模型,通过MTT法选择诱导增殖的最佳葡萄糖浓度。为课题后续实验提供实验基础。第二部分脱氢紫堇碱对高糖培养的心肌成纤维细胞Wnt信号通路的影响采用体外高糖诱导心肌成纤维细胞增殖模型,应用CCK8法检测细胞活力；MTT法检测细胞增殖能力；流式细胞仪检测细胞增殖周期；ELISA法观察细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原分泌能力及TGF-β1蛋白含量；western blot法检测β-catenin,GSK-3p,P-GSK-3p蛋白的表达,观察脱氢紫堇碱对成纤维细胞Wnt信号通路的影响。实验结果显示,脱氢紫堇碱可以抑制细胞增殖；降低Ⅰ型、Ⅲ型胶原细分泌；减少TGF-β1的合成；可以抑制β-catenin的表达,上调P-GSK-3p的表达。表明脱氢紫堇碱对高糖培养的心肌成纤维细胞的Wnt信号通路具有抑制作用。第三部分丹酚酸A对高糖培养的心肌成纤维细胞Wnt信号通路的影响采用体外高糖诱导心肌成纤维细胞增殖模型,应用MTT法检测细胞活力与细胞增殖能力；流式细胞仪检测细胞增殖周期；ELISA法观察细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原细分泌能力及TGF-β1蛋白含量；western blot法检测β-catenin,GSK-3β,P-GSK-3p蛋白的表达,观察丹酚酸A对于成纤维细胞Wnt信号通路的影响。实验结果显示,丹酚酸A可以抑制细胞增殖；降低Ⅰ型、Ⅲ型胶原细分泌；减少TGF-β1的合成；可以抑制β-catenin的表达,上调P-GSK-3β的表达。表明丹酚酸A对高糖培养的心肌成纤维细胞的Wnt信号通路具有抑制作用。第四部分人参皂苷Re对高糖培养的心肌成纤维细胞Wnt信号通路的影响采用体外高糖诱导心肌成纤维细胞增殖模型,应用MTT法检测细胞活力与细胞增殖能力；流式细胞仪检测细胞增殖周期；ELISA法观察细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原与TGF-β1蛋白的分泌能力；western blot法检测β-catenin,GSK-3p,P-GSK-3p的蛋白表达水平；观察人参皂苷Re对于成纤维细胞Wnt信号通路的影响。实验结果显示,人参皂苷Re可以抑制细胞增殖；降低Ⅰ型、Ⅲ型胶原细分泌；减少TGF-β1的合成；可以抑制β-catenin均表达,上调P-GSK-3p的表达。表明人参皂苷Re对高糖培养的心肌成纤维细胞的Wnt信号通路具有抑制作用。第五部分人参皂苷Rg1对高糖培养的心肌成纤维细胞Wnt信号通路的影响采用体外高糖诱导心肌成纤维细胞增殖模型,应用MTT法检测细胞活力和细胞增殖能力；流式细胞仪检测细胞增殖周期；ELISA法观察细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原及TGF-β1蛋白的分泌能力；western blot法检测β-catenin,GSK-3p,P-GSK-3p的蛋白表达水平；观察人参皂苷Rg1对于成纤维细胞Wnt信号通路的影响。实验结果显示,人参皂苷Rg1可以抑制细胞增殖；降低Ⅰ型、Ⅲ型胶原细分泌；减少TGF-β1的合成；在分子水平上可以抑制β-catenin的表达,上调P-GSK-3p的表达。表明人参皂苷Rgl对高糖培养的心肌成纤维细胞的Wnt信号通路具有抑制作用。本课题研究表明,活血化瘀方有效成分(脱氢紫堇碱,丹酚酸A,人参皂苷Re,人参皂苷Rgl)对于体外高糖诱导的心肌成纤维细胞模型有不同程度的抑制作用。同时糖尿病心肌纤维化的发生与Wnt信号通路的异常激活密切相关。糖尿病心肌纤维化的过程中,Wnt信号通路与TGF-β1信号通路可能存在协同作用。这些结果对糖尿病心肌纤维化的治疗有指导意义。