研究背景:细菌耐药性是导致临床感染治疗失败的重要原因,给患者的健康带来很大的威胁。最新的研究表明在高浓度的氟喹诺酮类抗生素处理细菌时,细菌胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平会增加并有可能参与杀菌过程。而亚致死浓度的抗生素诱导产生的ROS则会使细菌的突变率提高,促进多重耐药菌株的产生。OxyR是一个由巯基/二硫键转化来调控的转录因子,可以感应细菌细胞内氧化压力的变化,参与细菌的抗氧化、自发突变、铁代谢等活性过程,并调节着细菌致病能力以及外膜蛋白代谢。OxyR调控着细菌氧化还原微环境,参与细菌体内ROS水平的调节,但其在细菌产生耐药性过程中的作用和机制仍不明确。研究目的:本文旨在研究OxyR及其调控的氧化还原微环境相关基因在细菌产生耐药性过程中的作用,特别要考察细菌氧化还原微环境调控的相关基因与OxyR感应内源及外源ROS的压力以及调控氧化应激的机制,明确细菌产生耐药性的深层机制,阐明细菌耐药性产生的关键途径,探寻逆转耐药性的方法,为克服细菌耐药性提供新的思路。研究方法与结果:1.调控细菌氧化还原微环境相关基因缺陷的大肠杆菌突变株的构建我们利用质粒p KD4为模板,扩增带有卡那霉素抗性片段的同源打靶片段,并将其电转化进表达Red重组酶的大肠杆菌（Escherichia coli MG1655,含有辅助质粒p KD46）,通过同源重组,目的基因被抗性片段所替换,再利用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子,最后转入表达FLP重组酶的质粒p CP20将抗性基因删除,达到无痕敲除,并用PCR以及DNA测序技术鉴定基因敲除结果。成功构建了oxy R-、ahp C-、kat G-、grx A-、grx B-、grx C-、gsh B-等7个大肠杆菌突变菌株。2.耐抗生素大肠杆菌菌株的体外诱导使用2倍梯度浓度递增法不断提高培养基中诺氟沙星的浓度,对大肠杆菌进行长时间的体外诱导,获得具有最高耐药活性的大肠杆菌菌株。野生型大肠杆菌（对诺氟沙星的MIC0.078μg/m L）经过诱导,得到对诺氟沙星具有耐药性的菌株R-Norf-E.coli-WT,MIC为31.25μg/m L;oxy R-突变菌（对诺氟沙星的MIC 0.078μg/m L）经过诱导,得到针对诺氟沙星的耐药性细菌R-Norf-E.coli-oxy R-,MIC为625μg/m L。OxyR的缺失使得大肠杆菌产生的耐药菌株对诺氟沙星耐受能力增强近20倍,这一结果表明oxy R在大肠杆菌对抗诺氟沙星产生耐药性过程中是一个关键的抗耐药基因。除对诺氟沙星耐受外,这两株耐药菌株对氟喹诺酮类抗生素氧氟沙星和左氧氟沙星的敏感性也有较大的降低,但对其它作用机制的抗生素如卡那霉素和庆大霉素的敏感性没有大的变化。3.氧化还原相关基因对细菌突变率的影响为了明确与细菌氧化还原微环境调控相关的oxy R等基因在耐药性产生过程中的调控机制,我们考察了这些基因缺失对细菌突变率的影响。使用亚致死浓度的诺氟沙星处理大肠杆菌,将处理过的菌液按2倍梯度稀释法稀释后,分别接种于空白和含利福平抗性的平板上,培养过夜后统计菌落的数量。利用MSS最大化似然法测算每个培养物的突变发生次数（m）,计算突变率（μ）。结果显示,用药处理后大肠杆菌的突变率显著性高于未处理的菌株。对于缺乏oxy R基因的菌株,在诺氟沙星处理前后,与野生型相比突变率都会显著性升高,说明当细菌缺乏oxy R基因时,会更容易遭受氧化应激,引起DNA的损伤,进而导致突变率升高。4.OxyR对过氧化氢引起的氧化应激的调控OxyR是感应过氧化物的调控子,可感应ROS的存在并诱导抗氧化系统的应激响应。为考察OxyR调控的各基因在氧化应激状态下的变化,以及对调控氧化还原微环境的作用,我们用过氧化氢（H2O2）处理大肠杆菌以及各突变菌株,通过RT-q PCR检测其氧化还原相关基因的表达水平。随着H2O2浓度的增加,野生型菌株中ahp C、ahp F、kat G、trx B、trx C和grx A基因的m RNA水平也随之上调,其中kat G的m RNA水平增幅最大,表明kat G在清除H2O2方面起着非常重要的作用。而对于oxy R基因敲除的菌株,在氧化应激状态下ahp C、ahp F、grx A、trx B、trx C特别是kat G基因的m RNA水平明显下调。在trx B、trx C和grx A等基因受到OxyR调节的同时,OxyR的活性又受到硫氧还蛋白（Trx）系统和谷氧还蛋白（Grx）系统的协同调控,呈现典型的负反馈效应现象。5.大肠杆菌野生型与耐药菌的转录组分析为了深入了解OxyR在调控大肠杆菌应对诺氟沙星而进行重编码过程的作用,我们通过RNA-seq技术对E.coli-WT、E.coli-oxy R-、R-Norf-E.coli-WT和R-Norf-E.coli-oxy R-等菌株同时进行转录组分析。结果显示,与R-Norf-E.coli-WT相比,R-Norf-E.coli-oxy R-表达的差异基因数增加了两倍,表明OxyR的缺失使得更多的基因参与细菌基因组的重编码,产生更高水平耐药。其中,参与铁运输、铁外排以及Fe-S簇装配系统等铁代谢相关的基因表达在R-Norf-E.coli-oxy R-中显著性上调,但铁含量有明显降低。此外,R-Norf-E.coli-oxy R-体内的ROS水平显著性升高,说明细菌氧化应激和铁代谢共同调控细菌耐药性。6.对细菌硫氧还蛋白和谷氧还蛋白的总还原活性检测TRFS-green是用于检测哺乳动物硫氧还蛋白还原酶（Trx R）的荧光探针,体外实验表明TRFS-green是细菌Trx和Grx的选择性底物。这使得TRFS-green可用作检测细菌细胞中Trxs和Grxs总体活性的特异性探针。通过对多种突变株的检测,我们发现大肠杆菌Grx2和Grx3在维持细菌细胞内氧化还原环境中起着关键作用。用该探针检测在MBC浓度的抗生素处理E.coli时,部分抗生素在杀菌过程中会影响细菌二硫键还原的活性。此外,我们利用这一探针,检测WT、E.coli-oxy R-、R-Norf-E.coli-WT和R-Norf-E.coli-oxy R-等菌株中Trx以及Grx的总还原活性,R-Norf-E.coli-WT和R-Norf-E.coli-oxy R-耐药菌中Trx和Grx的活性与敏感菌株相比,有明显降低。这一结果与耐药菌中ROS水平显著性升高相吻合,同时也表明Trx和Grx的活性的降低可能和细菌耐药性密切相关。综上所述,我们构建了7种氧化还原相关基因敲除的大肠杆菌菌株,并发现E.coli-oxy R-在体外诱导耐药实验中更容易发生高水平的耐药;同时,在亚致死剂量的诺氟沙星诱导下,E.coli-oxy R-的突变率显著性升高,而突变与耐药直接相关,表明oxy R是一个关键的抗耐药基因。此外,在氧化应激的状况下,OxyR能够快速感应H2O2水平的增高,调控下游基因并诱导抗氧化系统。在R-Norf-E.coli-oxy R-中,铁代谢的基因表达显著性上调,体内的ROS水平显著性升高,说明氧化应激和铁代谢之间的协同作用与细菌耐药密切相关。利用TRFS-green荧光探针,我们发现大肠杆菌Grx2和Grx3在维持细菌细胞内氧化还原平衡过程中起着关键作用。此外,在耐药性细菌中,细菌的胞内Trx和Grx的总活性受到极大的抑制。