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农业害虫细胞周期及细胞凋亡调控机制的研究可为害虫综合防治提供新的视角和理论立足点,近年来越来越受到重视。gadd45基因具有阻滞细胞生长以及诱导DNA损伤的功能,是响应外源胁迫,调控细胞增殖和凋亡的关键因子之一,但是对于重大农业害虫小菜蛾,其编码的GADD45蛋白在DNA损伤修复、细胞增殖和细胞凋亡等一系列生理过程中的作用及其调控机制目前尚不明确。有鉴于此,本课题在成功克隆出小菜蛾gadd45基因的基础上,利用qPCR分析其在不同龄期和不同胁迫源如热激、紫外辐射和药剂诱导下的表达量变化;同时,构建其原核及真核的表达载体,对其进行原核和真核的体外诱导表达,并利用相关预测软件在蛋白水平对其进行表征;此外,通过构建小菜gadd45基因的dsRNA表达载体,利用qPCR分析饲喂法介导的RNA干扰试验后,gadd45基因及其相关基因的表达水平,以初步分析小菜蛾gadd45基因的功能。主要研究结果如下:根据GenBank及小菜蛾基因组数据,设计gadd45基因开放阅读框的特异引物,采用PCR技术在小菜蛾成虫cDNA中克隆得到gadd45基因的编码区序列,经测序可知该基因编码区序列长度有495 bp,共编码164个氨基酸,据此推测出其蛋白的分子量为17.94 kD,理论等电点值为4.884;通过推导的氨基酸序列分析发现小菜蛾GADD45与鳞翅目昆虫的GADD45蛋白同源性较高,与其他目的昆虫及脊索动物的GADD45蛋白同源性较低,与其分类地位相一致。通过荧光定量PCR对不同发育阶段的小菜蛾进行检测,发现小菜蛾gadd45基因在蛹期具有较高的相对表达量,与其他时期存在显著差异(P<0.05)。同时,研究gadd45基因在不同外源胁迫下的相对表达量,发现gadd45基因在不同外源胁迫下的相对表达水平不同:在热激处理下其相对表达量在处理4 h后达到最大值12.73;在紫外处理下其相对表达量在处理8 h后达到最大值4.23;在1 mg/mL虫酰肼药剂处理下其相对表达量在处理36h后达到最大值6.35;在10 mg/mL虫酰肼药剂处理下其相对表达量在处理24 h后达到最大值16.71;表明小菜蛾gadd45基因可以响应不同的外源胁迫,且根据细胞受损程度可以发挥DNA损伤修复和细胞凋亡等功能。通过构建gadd45重组质粒,对其进行原核重组表达,蛋白电泳检测发现能够在大肠杆菌中表达GADD45融合蛋白,其大小约18 kD,与氨基酸序列预测大小相符;而真核体外表达结果发现,转染gadd45重组质粒后,细胞损伤严重,大量细胞破裂,形态不规整。对小菜蛾幼虫饲喂dsRNA进行RNA干扰,发现小菜蛾幼虫化蛹高峰期推迟,qPCR检测发现小菜蛾gadd45基因的相对表达量降低且与gadd45基因相关的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CDK inhibitor)基因表达量也有所变化,表明饲喂法介导的RNA干扰试验切实可行,小菜蛾gadd45基因可能参与DNA损伤诱导、细胞生长周期阻滞和凋亡等生理活动。本研究为揭示小菜蛾gadd45与细胞周期调控及凋亡机制的关系奠定基础,为小菜蛾的综合防治研究提供新的线索。