论文部分内容阅读
原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）是一种慢性肝脏疾病，以肝内中小胆管损伤、胆汁淤积以及部分患者出现肝硬化为特征，约90~95%的患者血清可出现高度特异的抗线粒体抗体（antimitochondrial autoantibodies，AMAs）[1]。PBC好发于中年女性，近年来其发病率逐年升高，但其发病机制仍不明确。在治疗方面，熊去氧胆酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）是目前唯一公认的治疗药物，PBC患者对免疫抑制剂的治疗反应性差。微小RNA（microRNA，miRNA）作为一类序列短、不具有编码功能的小分子RNA，广泛参与基因的转录后调控[2]。已经有不少研究者证实了miRNA在类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）、多发性硬化症（multiple sclerosis，MS）以及溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）等一系列自身免疫性疾病的发生、发展以及治疗过程中发挥着重要作用，近年来miRNA在PBC中的作用也逐渐得到关注。本实验小组之前已经就PBC患者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）进行了差异性表达的miRNA芯片筛查，miR-17家族的miR-20a-5p、miR-106b和miR-93表达均显著上调，且位于miRNA-gene-network位于中心位置。白介素-8（interleukin-8，IL-8）是一种重要的炎症介质，Zimmermann H W等发现慢性肝脏疾病（chronic liver disease，CLD）患者血清IL-8水平升高，其中胆汁淤积性肝脏疾病和酒精性肝硬化患者IL-8水平升高最为显著，且IL-8水平与CLD的疾病进展以及非侵袭性肝硬化指标呈正相关[3]。本课题针对PBC患者miR-20a-5p和IL-8的表达水平进行检测，并对二者之间可能存在的调控关系进行探讨。第一部分：PBC患者miR-20a-5p和IL-8表达水平的检测我们收集长征医院PBC、RA、SLE、病毒性肝炎肝硬化（Viral hepatitis cirrhosis，VHC）住院患者和正常对照各20例，利用RT-PCR检测miR-20a-5p、IL-8在各类疾病PBMCs中的表达差异，血浆IL-8的表达水平采用ELISA方法检测。结果显示PBC患者的PBMCs中miR-20a-5p和IL-8的相对表达水平均较正常对照和其他疾病对照组显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。miR-20a-5p的相对表达量为正常对照组的6.33倍，IL-8的相对表达量为正常对照的7.96倍，PBC患者血浆IL-8的平均水平为89.5±36.6ng/L。第二部分：THP-1细胞中转染miR-20a-5p对IL-8表达水平的影响用100ng/ml的LPS对THP-1细胞进行预处理，6小时后转染miR-20a-5p的mimic和inhibitor，分别利用RT-PCR和ELISA检测IL-8表达水平的变化。结果显示转染了miR-20a-5p的mimic后，THP-1细胞IL-8的相对表达量降低，为空白对照的0.25倍，而转染了miR-20a-5p的inhibitor后THP-1细胞IL-8的相对表达量升高，为空白对照的4.02倍，差异均有统计学意义（P <0.05）。第三部分：miR-20a-5p对IL-8调控机制的探究为了进一步探究miR-20a-5p对IL-8表达水平调控的机制，我们在miRDB、TargetScan以及MicroRNA.org数据库对miR-20a-5p的靶基因进行预测，并利用双荧光素酶报告实验进行了miR-20a-5p与预测靶基因干扰素调节因子9（IFN regulatoryfactor9，IRF9）之间靶向作用关系的验证，最后针对IRF9设计了小干扰RNA（smallinterfering RNA，siRNA），利用RT-PCR和ELISA检测转染siRNA后IL-8表达的改变情况。MicroRNA.org数据库显示miR-20a-5p和IRF9之间有9个连续互补配对的碱基，存在紧密的靶向作用关系，而将miR-20a-5p的mimic与构建好的报告基因载体共转后，报告基因相对荧光值下调了30.3%（P <0.05），也说明miR-20a-5p对IRF9有靶向调节作用。在LPS预处理的THP-1单核细胞株内转染IRF9的siRNA以后，细胞和培养上清内IL-8的表达均下调，其改变趋势与转染了miR-20a-5p的mimic之后改变一致。转染miR-20a-5p以及siRNA后IRF9的蛋白表达水平均用Westernblot实验进行检测，结果与RT-PCR检测结果一致。结论PBC患者外周血miR-20a-5p和IL-8的表达均升高；在THP-1细胞株内miR-20a-5p对IL-8的表达有抑制作用，而这种抑制作用可能是通过靶作用于IRF9的表达而实现的。miR-20a-5p有可能作为一种保护性因素抑制IL-8的持续升高，而IRF9通过何种途径影响IL-8的表达有待进一步研究。