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由于强吸附作用、低溶解性以及难移动性等因素的影响,磷在土壤中有效性很低,因此磷成为限制植物生长的重要因子之一。在全球范围内,70%以上的可耕地面积为酸性和碱性土壤,磷在这类土壤中的存在形式,大部分为植物所不能吸收和利用的难溶性磷酸盐。为了确保植物的产量,提高磷素的利用率,全世界每年要施用的磷肥约达3千万吨,然而,在这些施用的磷肥中,由于吸附、沉降、以及转化成有机物等形式,80%的磷肥在土壤中固定下来,难以被植物吸收利用。所以,提高植物对土壤中难溶性磷的吸收能力,对于农业生态环境的改善以及农作物的增产具有十分重要的作用。现有的研究已经表明改变有机酸在植物体内的代谢水平,增加有机酸的分泌量是增强植物利用难溶磷酸盐的一种潜在分子机制。本研究从高效解磷真菌草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)中克隆了两个有机酸代谢途径关键酶基因,柠檬酸合酶(Cit)和苹果酸脱氢酶(MDH)基因,并对其序列进行了分析。在此基础上,将Po-mCit和Po-mMDH基因分别表达在大肠杆菌和烟草中,对转化体在磷胁迫条件下的生长状况进行了研究。具体研究内容及结果如下：1.根据已知真菌的苹果酸脱氢酶(MDH)、柠檬酸合酶(Cit)基因序列的同源性设计引物,以高效解磷真菌草酸青霉菌总RNA为模板,利用RT-PCR法,获得了草酸青霉菌线粒体苹果酸脱氢酶(Po-mMDH)和柠檬酸合酶(Po-mMDH) cDNA全序列,并由此推测相应的氨基酸序列。Po-mMDH基因cDNA (GenBank accession no. FJ550602)全长1284 bp,其中5’非编码区45 bp,3’非编码区216 bp,编码区1023 bp,编码一个由340个氨基酸构成的多肽,与土曲霉(Aspergillus terreus)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)mMDH具有85%以上的同源性,并具有高度保守的活性中心(VTTLDVVRASRFI),N端具有23个氨基酸的线粒体导向序列。Po-mCit基因cDNA (GenBank accession no.GQ981487)全长1716bp,包括5’端非编码区96bp,3’端非编码区205bp,开放阅读框1416bp,编码一个由471个氨基酸构成的多肽,与构巢曲霉(Aspergillus nidulans)和黑曲霉(Aspergillus niger) mCit具有85%以上的同源性,并具有高度保守的活性中心(GYGHAVLRKTDPR), N端都具有31个氨基酸的线粒体导向序列。2.分别将Po-mMDH和Po-mCit基因克隆到原核表达载体pET32a中,在大肠杆菌BL21(DE3)中分别获得可溶性融合表达产物。Po-mMDH工程菌中检测到较高的MDH活性(48.7μmol/mg protein),是对照的5倍,在以磷酸钙为唯一磷源的培养液中生长,Po-mMDH工程菌发酵液中苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和草酸的含量较对照明显增加,分别是对照的2.7、3.7、1.9、2.3和9.1倍,可溶性磷含量(134.8 mg／L)也明显高于对照(39.3 mg/L)。Po-mCit工程菌的Cit的活性为24.6μmol/mg protein,是对照的11倍。在以磷酸钙为唯一磷源的培养液中生长,Po-mCit工程菌发酵液中柠檬酸、苹果酸、乳酸、乙酸、和草酸的含量较对照明显增加,分别是对照的2.3、1.6、2.9、3.5和7.6倍,可溶性磷含量(156.6 mg/L)也明显高于对照。表明Po-mMDH或Po-mCit基因的表达能够促进有机酸的合成,增强大肠杆菌对磷的溶解能力。3.利用农杆菌转化技术获得了转Po-mMDH基因烟草,经过PCR、Southern-blot和RT-PCR验证,表明外源Po-mMDH基因已整合到烟草基因组中,并在转录水平上表达。转Po-mMDH基因烟草根系中MDH活性较野生型明显提高,低可利用磷条件下M1株系的酶活最高,达到38.6μmol/mg protein,相对于野生型增长2.2倍。低可利用磷胁迫诱导根系分泌的苹果酸含量是野生型的1.3-2.9倍。在以Al-phosphate (Al-P), Fe-phosphate (Fe-P)或Ca-phosphate (Ca-P)为唯一磷源的培养条件下,转基因烟草的生长状况明显好于野生型,干物重分别是野生型的2.5、2.3和2.3倍,总磷含量分别增长3.9、3.4和3.2倍。4.利用农杆菌转化技术获得了转Po-mCit基因烟草,并经过PCR和Southern-blot和RT-PCR验证,表明外源Po-mCit基因已整合到烟草基因组中,并在转录水平上表达。转Po-mCit基因烟草根系Cit活性较野生型明显提高,在难溶磷(Al-P)条件下,转基因株系的Cit酶活性最高,其中C2株系的Cit酶活性(28.4μmol/mg protein)是野生型(8.8μmol/mg protein)的3.2倍。根系分泌的柠檬酸含量分别增长1.6、2.7、2.5和2.3倍。在难溶磷(Al-P)培养条件下,转基因株系的地上部干重和根干重明显高于野生型,总磷含量也明显提高,较野生型分别增加1.6、2.4、1.9和1.8倍。