【摘 要】
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目的:前期的实验结果表明,氟导致的神经系统兴奋性毒性与兴奋性谷氨酸受体NMDA的过度激活有关,尤其是NMDA的NR2B亚基表达升高,导致细胞内钙离子紊乱,引发细胞一系列生命活动的改变。但是一定浓度的氟化钠引起神经系统HE染色下组织结构改变不明显。因此,本研究拟分析氟化钠暴露对原代星形胶质细胞超微结构、细胞内钙离子水平以及细胞自噬、凋亡等重要生命的影响,以进一步阐明氟导致神经系统损伤的分子机制。方法
【基金项目】
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国家自然科学基金（U1812403-6、81560512）；
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目的:前期的实验结果表明,氟导致的神经系统兴奋性毒性与兴奋性谷氨酸受体NMDA的过度激活有关,尤其是NMDA的NR2B亚基表达升高,导致细胞内钙离子紊乱,引发细胞一系列生命活动的改变。但是一定浓度的氟化钠引起神经系统HE染色下组织结构改变不明显。因此,本研究拟分析氟化钠暴露对原代星形胶质细胞超微结构、细胞内钙离子水平以及细胞自噬、凋亡等重要生命的影响,以进一步阐明氟导致神经系统损伤的分子机制。方法:1.提取新生2-3天的SD大鼠大脑皮层的星形胶质细胞,用细胞免疫荧光法鉴定细胞类型。胶质纤维酸蛋白（GAFP）阳性者记为星形胶质细胞,随机选取放大倍数为200倍的3个视野,计阳性细胞占比,取平均值。2.用CCK8法筛选合适的氟化钠处理浓度和处理时间,设置对照组（单纯培养基培养）,低氟组（Na F浓度0.1mmol/L）,高氟组（Na F浓度1mmol/L）。3.透射电子显微镜观察氟对原代星形胶质细胞超微结构的影响。4.选用合适的N-甲基D-天冬氨酸受体（NMDAR）抑制剂艾芬地尔（Ifenprodil）浓度,将细胞分为6组,分别为对照组（单纯培养基培养）,低氟组（Na F浓度0.1mmol/L）,高氟组（Na F浓度1mmol/L）,对照抑制剂组（Ifenprodil浓度10μmol/L）,低氟抑制剂组（Na F浓度0.1mmol/L、Ifenprodil浓度10μmol/L）,高氟抑制剂组（Na F浓度1mmol/L、Ifenprodil浓度10μmol/L）。5.6组细胞均在37°、5%CO2培养箱培养24h后,检测各种形态学和生化指标值。包括:（1）Western-Blot检测各组细胞自噬相关蛋白ULK1、Beclin1、LC3、P62的表达。（2）流式细胞仪检测各组细胞凋亡、坏死比例。（3）激光共聚焦观察各组细胞钙离子分布情况。结果:1.提取的原代细胞中,星形胶质细胞比例达（94±0.73）%,符合实验要求。2.透射电子显微镜显示:与对照组相比,低氟组细胞细胞膜肿胀,细胞器轻微受损,线粒体-内质网偶联增多,可见自噬小体、自噬溶酶体结构的存在。而高氟组细胞与对照组相比,细胞膜肿胀明显,细胞器严重受损,细胞核也有不同程度的损伤。具体表现为线粒体明显皱缩,变细、变小;粗面内质网明显扩张呈空泡状,表面核糖体大量脱颗粒;高尔基体扩张、肥大;细胞核凹陷严重,核周隙增宽,染色质边集。另外,未见初级、次级溶酶体,仅可见自噬溶酶体。与低氟组比较,高氟组线粒体-内质网偶联更多。3.Western-Blot结果显示,与对照组相比,低氟组自噬相关蛋白表达略微升高或降低,结果没有统计学差异（P＞0.05）;而高氟组自噬相关蛋白水平明显降低,结果有统计学差异（P＜0.05）。对照抑制剂组自噬相关蛋白表达水平增高,结果有统计学差异（P＜0.05）。低氟抑制组、高氟抑制剂组与相应的低氟组、高氟组相比,自噬水平均有改善,其中高氟抑制组结果具有统计学差异（P＜0.05）。4.流式细胞仪结果显示:与对照组相比,低氟组细胞凋亡和坏死不明显,而高氟组凋亡和坏死细胞比例明显增多,结果有统计学差异（P＜0.05）;高氟抑制组与高氟组相比,晚凋和坏死比例减少,结果有统计学差异（P＜0.05）。5.激光共聚焦法检测线粒体钙离子探针显示:与对照组相比,低氟组细胞钙离子分布差异不明显,而高氟组细胞线粒体出现明显钙超载,差异有统计学意义（P＜0.05）。同样,高氟抑制剂与高氟组相比,线粒体钙超载减轻,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:1.氟可导致原代星形胶质细胞超微结构发生改变,随着氟浓度的增加,细胞内细胞器和细胞核损伤加重。一定浓度时自噬结构增多,但氟浓度过高时溶酶体受损严重。2.随着染氟浓度增加,星形胶质细胞自噬水平降低、细胞凋亡和坏死比例增加,并且线粒体发生钙超载。提示线粒体钙紊乱可能是导致星形胶质细胞损伤的重要因素。3.应用谷氨酸受体NMDAR抑制剂Ifenprodil后,星形胶质细胞线粒体钙浓度及凋亡和坏死比例降低,细胞自噬水平增加,可能是由于抑制了星形胶质细胞表面NMDA受体的激活,钙内流减少,进而调节细胞的自噬和凋亡水平。4.电镜观察到氟暴露时,内质网-线粒体接触增多,推测可能是内质网与线粒体钙交换增加有关,其钙离子通过内质网相关线粒体膜（MAMs）的ITPR-MCU通道从内质网进入线粒体,引起线粒体钙超载。5.氟引起星形胶质细胞内钙离子信号紊乱是导致其发生一系列重要生命活动转变的重要机制。星形胶质细胞的损伤加重了氟对神经系统的损伤。
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