骨肉瘤(osteo sarcoma)是最常见的骨的原发性恶性肿瘤,好发于青少年,具有较高的致残、致死率,单纯手术治疗的5年生存率仅20%。自上世纪70年代开始,随着化疗的引入,骨肉瘤的控制率得到明显提高,不伴明显转移的原发性骨肉瘤患者5年生存率上升到60%-70%。临床上骨关节假体的运用也让保肢手术成为可能,患者能够恢复患肢的功能和外形。因此,骨肉瘤患者在远期生存和生活质量上均得到显著提高。目前,如何治疗出现复发、转移的骨肉瘤患者成为临床上的棘手问题。首先,这类患者再次治疗时,肿瘤发生耐药,需要改用高强度的化疗方案,随之而来的药物毒性会造成全身不良反应。第二,局部复发可能导致保肢后再次截肢,给患者造成严重的心理负担,加速疾病发展。第三,广泛的肺转移导致呼吸衰竭,最终造成不可逆转的多器官衰竭。目前这类患者的5年生存率不足20%。肿瘤干细胞是指肿瘤中具有再生肿瘤和异质性分化潜能的细胞,它与肿瘤的发生发展、复发转移等密切相关,如何分选并且靶向杀伤这类细胞成为当今的研究热点。端粒酶是维持端粒长度的关键酶,正常机体内,端粒酶仅存在于精原细胞及少量成体干细胞内。而在大部分肿瘤中,都可检测到端粒酶活性。因此,端粒酶同肿瘤干细胞的关系值得进一步探讨。第一部分端粒酶在骨肉瘤干细胞和非干细胞中差异表达情况[目的]通过无血清低粘附环境富集骨肉瘤干细胞,同普通贴壁培养的骨肉瘤细胞对比,探讨骨肉瘤干细胞和非干细胞中端粒酶表达及活性情况。[方法]获取原发性骨肉瘤患者手术切除标本,分离培养人原代骨肉瘤细胞(OS1-4),获取并培养骨肉瘤细胞系MG63、MNNG/HOS、143B。每种细胞分为肿瘤干细胞组和正常对照组,正常组细胞培养于含10%FBS、双抗的RPMI-1640完全培养基中,肿瘤干细胞组培养在含lOng/mL EGF、1Ong/mL FGF、B27的RPMI-1640的条件培养基中。培养14天后,将细胞离心收集。利用Real-time PCR法检测各组细胞中hTERT mRNA表达水平,TRAP-ELISA法检测各组端粒酶活性水平。分析比较不同细胞骨肉瘤干细胞组和非干细胞组中hTERT mRNA水平及端粒酶活性。[结果]骨肉瘤干细胞较非干细胞组hTERT mRNA表达平均增高3.47±1.10倍,差异具有显著性(P<0.01)。骨肉瘤干细胞较非干细胞组端粒酶活性平均增高3.15±0.34倍,差异具有显著性(P<0.01)。[结论]通过无血清低粘附环境富集的骨肉瘤干细胞,具有显著增高的端粒酶表达和／或活性,这种差异性表达可能用于分离骨肉瘤干细胞。第二部分构建能够检测端粒酶活性的慢病毒报道载体[目的]构建能够在单细胞水平、存活状态下检测端粒酶活性的方法。[方法]化学合成hTERT启动子区域(长约1.5kb),并将其克隆到慢病毒转录报道载体pGreenFire1-mCMV-EF1-Puro (TR010PA-P)中,5’端为ClaI识别位点,3’端为EcoRI识别位点。将克隆好的质粒lenti-hTERTp-GFP送往上海生工生物工程公司进行测序鉴定。将pGreenFire1-mCM V-EF1-Puro和包装质粒共同转染到293T细胞中,获取上清液,离心获取慢病毒。将上述病毒感染至骨肉瘤细胞系MG63、 MNNG/HOS.143B中,在培养基中添加5ug/mL嘌呤霉素,培养7天,筛选稳定感染的细胞系。流式检测GFP荧光表达情况并根据GFP表达状态将细胞分为GFP阳性组和GFP阴性组,将细胞离心收集,利用Real-time PCR法检测各组细胞中hTERT mRNA表达水平,TRAP-ELISA法检测各组端粒酶活性水平,并分析hTERT mRNA及端粒酶活性间相关性。[结果]成功构建慢病毒启动子报道质粒lenti-hTERTp-GFP,测序证实启动子区域序列正确。合成慢病毒感染至骨肉瘤细胞中,获得稳定感染的细胞系MG63-puro、 MNNG/HOS-puro.143B-puro。三种细胞系的GFP阳性比率分别为23.24±3.88%、15.51±2.79%和22.44±2.74%。根据GFP表达状态可将骨肉瘤细胞分为两群,GFP阳性细胞中hTERT mRNA表达水平高于GFP阴性组,平均增高3.29±0.45,差异有统计学意义(P<0.01)。同时,GFP阳性细胞中端粒酶活性高于GFP阴性组,平均增高3.424±0.89,差异有统计学意义(P<0.01)。 MG63-puro、MNNG/HOS-puro、143B-puro三种细胞中hTERT mRNA及端粒酶活性间呈线性相关(r=0.94,P<0.01; r=0.88,P<0.01; r=0.95, P<0.01)。[结论]成功构建能够在单细胞水平、存活状态下检测端粒酶活性的方法,方便分选后进行后续功能实验。第三部分端粒酶阳性骨肉瘤细胞具有干细胞样特性[目的]利用端粒酶活性分选骨肉瘤干细胞。[方法]合成端粒酶报道慢病毒并感染至骨肉瘤细胞中,获得稳定感染的细胞系MG63-puro、MNNG/HOS-puro、143B-puro,利用流式细胞仪将上述细胞系按照GFP表达状态分为GFP阳性组和GFP阴性组,检测各组干细胞样特性。具体实验包括：1、流式细胞仪检测各组细胞CD117/Stro-1双阳性率；2、Western-blot检测各组细胞干细胞相关基因表达情况；3、原代和二代悬浮克隆球形成实验比较各组细胞离体自我更新能力；4、细胞经有限稀释后行裸鼠皮下及原位移植,根据成瘤情况利用ELDA法推算干细胞比例；5、裸鼠皮下连续移植实验评估细胞体内再生肿瘤能力,即GFP阳性MG63细胞形成肿瘤球后,分离培养,以5,000细胞数再次接种于皮下,观察再次成瘤率；6、端粒酶阳性细胞行单细胞悬浮培养,待肿瘤球形成后,荧光显微镜下观察GFP表达情况。端粒酶阳性细胞接种成瘤后,获取肿瘤组织,部分组织消化成单细胞悬液,流式检测GFP表达情况,部分组织固定后切片,荧光显微镜下观察GFP表达情况；7、成骨、成脂诱导评估细胞多向分化能力。[结果]1、MG63-puro、MNNG/HOS-puro及143B-puro经分选的GFP阳性细胞CD117/Stro-1双阳性率分别为5.62±0.75%,6.24±0.09%和8.27±0.41%,较GFP阴性组平均增高4.51±0.55倍,差异具有显著性(P<0.01)；2、干细胞相关基因中Oct4和Sox2在GFP阳性细胞中显著增高(P<0.01),而Nanog表达在两组间无显著差异(P>0.05)；3、原代悬浮克隆球形成实验显示：三种细胞系,GFP阳性细胞较GFP阴性细胞克隆形成率平均增高3.8±0.9倍,差异具有统计学意义(P<0.01)。而二代悬浮克隆球形成实验显示这种差别更加明显,GFP阴性细胞基本无法形成肿瘤球(P<0.01)；4、MG63细胞经有限稀释后行裸鼠皮下移植,经推算GFP阳性细胞中干细胞比例较GFP阴性细胞高374倍(P<0.01)。MNNG/HOS细胞经有限稀释后行裸鼠原位移植,经推算GFP阳性细胞中干细胞比例较GFP阴性细胞高232倍(P<0.01)；5、连续移植实验显示5,000个GFP阳性MG63细胞具有83.3%肿瘤再生率；6、端粒酶阳性细胞形成肿瘤球后,荧光显微镜下观察可见肿瘤球为异质性,同时包含GFP阳性和阴性细胞,典型时克隆球中仅含一个GFP阳性细胞。端粒酶阳性细胞接种成瘤,流式及荧光显微镜下均显示GFP阳性细胞可分化出GFP阴性细胞；7、GFP阳性细胞具有成骨、成脂分化能力,而GFP阴性细胞无多向分化能力。[结论]端粒酶阳性骨肉瘤细胞具有肿瘤干细胞样特性。第四部分骨肉瘤干细胞具有侵袭、转移和耐药能力[目的]利用端粒酶活性分选骨肉瘤干细胞,分析其耐药、侵袭和远处转移能力。[方法]利用端粒酶活性将骨肉瘤细胞系MG63-puro、MNNG/HOS-puro及143B-puro分为干细胞组及非干细胞组,Matrigel-Transwell实验检测各组细胞离体侵袭能力；利用143B细胞检测细胞在体转移能力：143B细胞分成干细胞组和非干细胞组,行裸鼠原位移植,通过肺部X片及肺组织切片检测肺部肿瘤,比较不同细胞肺部转移能力；上述细胞根据端粒酶活性分为分为干细胞组及非干细胞组,分别以不同浓度阿霉素处理24小时,比较各组细胞耐药性。[结果]Matrigel-Transwell实验表明干细胞组较非于细胞组离体侵袭能力平均增强约3倍,差异具有统计学意义(P<0.05)。X片检查发现有75%(6/8)的143B-TELpos原位移植瘤出现肺部结节,而143B-TELneg未见明显肺部结节；组织切片结果也显示细胞143B-TELpos的在体侵袭能力明显强于143B-TELneg细胞(P<0.01)。三种细胞均显示骨肉瘤干细胞组较非干细胞组对阿霉素敏感性减低,差异具有统计学意义(P<0.01)。[结论]骨肉瘤干细胞具有较强的侵袭、转移和耐药能力。第五部分骨肉瘤干细胞具有上皮-间质样变特性[目的]利用端粒酶活性分选骨肉瘤干细胞,分析其上皮-间质特性。[方法]利用端粒酶活性将骨肉瘤细胞系MG63-puro分为干细胞组及非干细胞组,利用免疫荧光法检测vimentin表达,显微镜下计算细胞长／短径比值；利用Western-blot检测上皮-间质特异性蛋白表达水平,包括：E-cadherin、pan-cytokeratin、 N-cadherin、vimentin、desmin和a-sma;利用Real-time PCR和Western-blot检测上皮-间质样变相关蛋白表达水平,包括：Twist1、Twist2、Snail1、Slug、Zebl和Zeb2；利用划痕实验及Transwell侵袭实验比较不同组细胞离体迁移侵袭能力。[结果]免疫荧光染色显示MG63端粒酶阳性细胞vimentin表达量显著高于MG63端粒酶阴性细胞(P<0.05),MG63端粒酶阳性细胞长／短径平均比值为3.34,而MG63端粒酶阴性细胞长／短径平均比值为2.14,两者相比差异具有统计学意义(P<0.05); Western-blot结果显示MG63端粒酶阳性细胞中N-cadherrin、vimentin及desmin表达量高于MG63端粒酶阴性细胞,而E-cadherin则低于MG63端粒酶阳性细胞,两者相比差异具有统计学意义(P<0.05),pan-cytokeratin在两组细胞中均未见表达,而a-sma在两组细胞中均有表达,但无明显差别(P>0.05)；进一步Real-time PCR和Western-blot结果显示Twist1、Snail1、Slug、Zeb1在MG63端粒酶阳性细胞中表达量高于MG6端粒酶阴性细胞,差异有统计学意义(P<0.05),而Twist2和Zeb2则未见明显差别(P>0.05)；划痕实验及Transwell侵袭实验显示MG63端粒酶阳性细胞的迁移及侵袭能力均强于MG63端粒酶阴性细胞,两者相比差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]骨肉瘤干细胞具有上皮-间质样变倾向。第六部分端粒酶抑制剂可选择性骨肉瘤干细胞[目的]探讨端粒酶抑制剂在靶向针对骨肉瘤干细胞方面的作用及意义。[方法]利用端粒酶活性将骨肉瘤细胞系MG63-puro、MNNG/HOS-puro及143B-puro分为干细胞组及非干细胞组,进行普通贴壁培养,在培养基中添加端粒酶抑制剂MST312处理96小时,MTT实验检测MST312细胞毒性。进一步将端粒酶阳性的干细胞置于无血清低粘附培养基中进行悬浮培养,分为实验组和对照组,实验组在培养基中添加端粒酶抑制剂MST312,对照组仅添加溶剂DMSO,比较两组悬浮克隆形成率。取裸鼠8只,将MG63端粒酶阳性细胞接种到裸鼠皮下构建移植瘤模型,随机分为MST312处理组和对照组,观察肿瘤生长,待成瘤后,获取肿瘤,消化成单细胞悬液,流式细胞仪分析细胞GFP表达情况。[结果]MST312可抑制MG63-puro、MNNG/HOS-puro及143B-puro细胞的生长,但对肿瘤干细胞抑制程度更强,差异有显著性(P<0.05)；悬浮克隆球MST312可抑制肿瘤干细胞的自我更新,平均抑制率为58.3±5.1%；裸鼠移植瘤实验表明,MST312可明显抑制MG63端粒酶阳性细胞成瘤,瘤体大小平均仅为对照组1/5,进一步分析显示MST312处理的MG63端粒酶阳性细胞移植瘤中GFP阳性比例仅为7.9±2.2%,显著低于对照组27.3±3.0%(P<0.05)。[结论]端粒酶抑制剂可靶向针对骨肉瘤干细胞,具有良好的临床应用前景。