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原发性肝癌作为全球范围内常见癌症是医疗难题之一。现阶段,中草药提取物因药效强、易提取等优点广泛应用于多种疾病的治疗。β-咔啉-3-羧酸乙酯(Ethyl-β-carboline-3-carboxylate,β-CCE)是苦木提取物β-咔啉类化合物,具有抗炎、抗菌、治疗神经方面疾病以及抗癌等多种药物活性。但其抗癌药理活性的研究尚不完善。过氧化物酶V(Peroxiredoxin V,Prx Ⅴ)是Prxs家族的一员,广泛分布在各种类型的细胞器中,尤其在线粒体和细胞质中,发挥着较强的抗氧化能力,通过清除细胞内过多的活性氧(Reactive Oxigen Species,ROS)和活性氮(Reactive Ntirogen Oxide Species,RNS),维持细胞内氧化还原稳态。本研究针对Prx Ⅴ能够有效调节细胞内活性氧的特点,通过构建Prx Ⅴ过表达Hep G2细胞系,探究β-CCE诱导Hep G2细胞凋亡过程中Prx Ⅴ对肝癌细胞凋亡的调控作用及其作用机制,为β-CCE临床肝癌治疗提供有效靶点,同时为揭示Prx Ⅴ在肝癌化疗中的调控作用提供新的理论依据。为评价β-CCE对肝癌细胞的毒性作用和对Prx Ⅴ蛋白表达的影响。利用MTT法检测三种肝癌细胞对β-CCE的敏感性,检测浓度段/时间段β-CCE对Hep G2细胞存活率的影响,同时检测β-CCE对两种正常肝细胞的细胞毒性;利用结晶紫染色法检测β-CCE对Hep G2细胞集落形成能力的影响。利用细胞划痕实验检测β-CCE对Hep G2细胞迁移能力的影响。利用荧光显微照相技术检测β-CCE处理Hep G2细胞后细胞和线粒体内活性氧表达水平,检测药物处理后线粒体损伤以及细胞活性。利用蛋白免疫印迹法检测β-CCE对Hep G2细胞凋亡蛋白、Prxs蛋白家族表达量以及MAPK信号通路变化等情况。为利用Prx Ⅴ过表达和Mock组Hep G2细胞系阐明Prx Ⅴ在β-CCE诱导肝癌细胞凋亡过程中的调控作用及其机制,首先利用生物信息学软件分析Prx Ⅴ在肝癌组织和正常组织中的表达差异以及对肝癌患者生存率的影响,提示Prx Ⅴ与临床肝癌的发生、发展和预后等方面的关联性。然后,利用慢病毒载体构建Prx Ⅴ过量表达和Mock(对照)细胞系,利用Western boltting检测法鉴定慢病毒载体构建Prx Ⅴ过表达Hep G2细胞以及Mock组Hep G2细胞系构建成功。利用MTT法检测并证明β-CCE对Mock&Prx Ⅴ过表达Hep G2细胞的细胞存活率的影响,利用荧光显微照相技术对比β-CCE处理Mock&Prx Ⅴ过表达Hep G2细胞后细胞内和线粒体内活性氧水平的差异,对比细胞线粒体损伤以及细胞活性变化等情况,利用蛋白免疫印迹法检测β-CCE对Mock&Prx Ⅴ过表达Hep G2细胞凋亡相关蛋白的表达水平以及MAPK信号通路的变化情况。结果显示,β-CCE能够有效降低Hep G2细胞存活率,并抑制细胞集落形成和迁移能力。经过对药物浓度的筛选,选用80μg/m L及100μg/m L进行后续实验,发现在此浓度下,β-CCE能够明显增加细胞和线粒体内的活性氧蓄积,同时诱导线粒体膜电位降低。另外,通过调查凋亡相关蛋白表达水平发现,细胞线粒体依赖性凋亡蛋白cleavage-Caspase 9以及促凋亡蛋白Bad、Bax和cleavage-Caspase 3表达量显著上升,抗凋亡蛋白Bcl2和Bcl-x L表达量显著下降,证明β-CCE通过增加细胞内活性氧水平损伤细胞线粒体,进而诱导Hep G2细胞发生凋亡。对信号传导途径的分析结果显示,β-CCE能够有效影响MAPK信号通路,降低ERK蛋白磷酸化水平,增加JNK和P38蛋白磷酸化水平。当活性氧清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)预处理细胞后,能够有效降低由β-CCE导致的Hep G2细胞内和线粒体内活性氧水平增加,同时引起细胞线粒体膜电位显著下降,减少细胞凋亡,下调MAPK信号通路的激活。实验发现,Hep G2细胞内Prx Ⅴ蛋白表达量随着药物的处理而降低,但NAC的预处理会抑制β-CCE诱导的Prx Ⅴ蛋白表达水平下调的现象。通过利用β-CCE处理Mock&Prx Ⅴ过表达Hep G2细胞存活率实验发现,Prx Ⅴ过表达组Hep G2细胞存活率高于Mock组,且Prx Ⅴ过表达组细胞内和线粒体活性氧水平低于Mock组,同时过表达Prx Ⅴ组线粒体膜电位高于Mock组。另外,过量表达Prx Ⅴ有效降低了β-CCE诱导的细胞凋亡,同时有效下调了MAPK信号通路的激活。利用NAC分别处理两组细胞后,两组细胞内和线粒体内活性氧水平以及线粒体损伤情况均显著下降,细胞凋亡情况明显降低,细胞的MAPK信号通路激活程度被显著逆转。这些结果显示,过量表达Prx Ⅴ能够有效抑制由β-CCE诱导的Hep G2肝癌细胞凋亡,并且清除活性氧是Prx Ⅴ发挥这些作用的关键因素。综上所述,Prx Ⅴ在β-CCE诱导的Hep G2肝癌细胞凋亡过程中具有重要的调控作用。其作用机制主要是通过有效清除细胞内活性氧水平,降低线粒体损伤,下调活性氧依赖性的MAPK信号通路和凋亡相关蛋白,最终降低由β-CCE介导的Hep G2肝癌细胞线粒体依赖性的细胞凋亡。本研究阐释了Prx Ⅴ在β-CCE诱导肝癌细胞凋亡发生中发挥的作用机制,同时为肝癌的基因治疗提供可行依据,为肝癌化疗药物的开发提供新的理论依据。