【摘 要】
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L-高丝氨酸作为一种非蛋白质氨基酸,是L-天冬氨酸衍生物和一些必需氨基酸（如L-苏氨酸,L-蛋氨酸,L-异亮氨酸）的前体物质,并且它作为潜在的平台可生产许多重要的化合物。虽然目前微生物发酵法生产L-高丝氨酸已经取得一些进展,但是规模化生产L-高丝氨酸存在产量低,需要昂贵的培养基添加物（如氨基酸、诱导剂、抗生素）等问题。针对上述问题,本研究利用代谢工程方法构建了一株非营养缺陷型、非诱导、不携带质粒的
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L-高丝氨酸作为一种非蛋白质氨基酸,是L-天冬氨酸衍生物和一些必需氨基酸（如L-苏氨酸,L-蛋氨酸,L-异亮氨酸）的前体物质,并且它作为潜在的平台可生产许多重要的化合物。虽然目前微生物发酵法生产L-高丝氨酸已经取得一些进展,但是规模化生产L-高丝氨酸存在产量低,需要昂贵的培养基添加物（如氨基酸、诱导剂、抗生素）等问题。针对上述问题,本研究利用代谢工程方法构建了一株非营养缺陷型、非诱导、不携带质粒的L-高丝氨酸工程菌,实现L-高丝氨酸的高效合成。研究结果如下:（1）动态抑制L-高丝氨酸降解途径。通过使用自调节启动子（PfliA,PfliC,PflgC）动态调控thrB的表达,并在基因组上整合了一个拷贝的解除反馈抑制的thrA fbr基因。摇瓶发酵结果表明,自调节启动子替换后的菌株生长并未受到影响,并且能有效积累L-高丝氨酸。其中以PfliC替换后的菌株HOM-5表现出较好的生产性能,积累L-高丝氨酸1.8 g/L,为进一步途径优化和L-高丝氨酸生产奠定了基础。（2）增加前体物供应。首先,为提高草酰乙酸供应,编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因ppc被过表达,并构建菌株HOM-7。摇瓶发酵结果显示,相对于HOM-5,L-高丝氨酸产量提高了 61.1%,达2.9 g/L。再者,过表达编码天冬氨酸解氨酶的基因aspA,以增加L-天冬氨酸这一前体物的供应,最终工程菌HOM-8 L-高丝氨酸产量达4.6 g/L,相对于HOM-7提高了 58.6%。同时,在发酵液中检测到了少量L-天冬氨酸积累（1.2 g/L）。（3）增强L-高丝氨酸合成代谢通量,考察多拷贝thrA对L-高丝氨酸生产的影响。首先,在基因组上整合了第二个拷贝thrAfbr基因,并获得菌株HOM-9。发酵结果显示,HOM-9的L-高丝氨酸产量较HOM-8提高了 76.1%,达8.1 g/L。接着,第三拷贝thrAfbr基因被整合,并获得菌株HOM-10。发酵结果显示,L-高丝氨酸产量较HOM-9提升了 8.6%,达 8.8 g/L。（4）增加NADPH的合成。在L-高丝氨酸合成途径中,每合成一分子L-高丝氨酸需要两分子的NADPH。为了增加NADPH供应,过表达了编码吡啶核苷酸转氢酶的基因pntAB,并获得菌株HOM-11。摇瓶发酵结果显示,相比于HOM-10,HOM-11发酵液中L-高丝氨酸产量提高了 21.6%,达10.7 g/L。并且此时L-天冬氨酸减少到不可探测的水平。（5）促进L-高丝氨酸的外排。高浓度的L-高丝氨酸会抑制L-谷氨酸脱氢酶的活性,并且随着胞内L-高丝氨酸逐渐积累使得细胞生长受到毒性抑制。在本研究中通过使用不同强度的启动子PrhtA,Ptrc,Plpp调控L-高丝氨酸转运蛋白编码基因rhtA以获得最适表达水平。摇瓶发酵结果显示,过表达rhtA的三株菌L-高丝氨酸生产显著增加,并且生物量也显著提升。值得注意的是,以Plpp过表达rhtA的菌株HOM-14,L-高丝氨酸产量最高,达到19.9 g/L,相比于HOM-11提高了 86.0%。（6）通过对工程菌HOM-14进行5 L发酵罐分批补料发酵培养,L-高丝氨酸产量在48 h达到最高83.5 g/L,生产强度达到1.74 g/L/h,糖酸转化率达到0.4 g/g。相比于之前所报道的L-高丝氨酸生产菌,该菌株的生产效率（产量、生产强度、转化率）达到最高。
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