论文部分内容阅读
肌醇（Inositol）是各种生物体中不可或缺的重要成分,广泛应用于医药、化妆品、食品和饲料工业等领域。但传统的肌醇生产方法如:沉淀水解、化学合成和电渗析等方法,存在过程繁琐、污染环境和产率低下等问题。为了满足人类对肌醇日益增长的需求。近年来,一种新型环保的多酶水解淀粉生产肌醇的方法得到广泛关注。肌醇-1-磷酸合成酶（Inositol-1-phosphate synthase,IPS）是该方法生产肌醇的关键酶,但是由于游离酶十分昂贵,而且具有稳定性差、不可重复利用等因素,限制了酶法生产肌醇的工业化应用。因此,本课题采用交联酶聚体（CLEAs）、商品化环氧树脂（1000EP）和乙二胺（EDA）修饰的环氧树脂（1000 EP-EDA）固定IPS,成功制备出了肌醇-1-磷酸合成酶交联酶聚体（CLEAs-IPS）、环氧树脂固定化肌醇-1-磷酸合成酶（1000EP-IPS）和EDA修饰环氧树脂固定化肌醇-1-磷酸合成酶（1000 EP-EDA-IPS）。研究了固定化肌醇-1-磷酸合成酶的催化性能及合成肌醇性能。主要研究内容如下:1.基于交联酶聚体的形成机理,优化了CLEAs-IPS的制备条件,研究了其催化性能。结果表明,在IPS酶浓度为0.4 mg/m L,沉淀剂硫酸铵饱和度为70%,交联剂戊二醛浓度为0.05%（v/v）,交联时间为3 h,缓冲液为50 m M Tris-HCl（p H=7.2）条件下,CLEAs-IPS的酶活回收率达到最大值76.3%,比优化前提高了6.4%。正置荧光显微镜与傅里叶红外光谱（FTIR）分析结果显示,IPS与戊二醛成功交联形成CLEAs-IPS。CLEAs-IPS最适催化温度与游离酶保持一致,最适催化p H为7.0;100℃处理2 h,CLEAs-IPS残留酶活为20.9%,但是游离酶基本失活（残留酶活为2.9%）;在p H值为6.0的缓冲液中处理2 h游离酶完全失活,但是CLEAs-IPS还能保留74.1%的酶活;表明CLEAs-IPS比游离酶有较好的高温耐受性和酸耐受性。2.利用商品化环氧基树脂固定IPS（1000 EP-IPS）,优化了制备条件并研究了其催化性能。结果显示,在环氧树脂为1000 EP,树脂添加量为300 mg（m/v）,IPS酶浓度为0.7 mg/m L,交联时间为24 h,缓冲液为50 m M Tris-HCl（p H=8.0）条件下,酶活回收率达到最佳值为72.5%,比优化前提高了29.9%。正置荧光显微镜与FTIR分析显示,IPS被成功固定在1000 EP-IPS上。1000 EP-IPS的最适催化温度为80℃,而游离IPS为90℃;最适催化p H与游离IPS保持一致;1000 EP-IPS最适催化温度的下降有利于降低生产成本;而且,1000 EP-IPS在变性剂（甲醇、尿素、SDS、胰蛋白酶）处理2 h后相比游离酶提高10%酶活残留率,1000 EP-IPS被重复利用10次后还可以保留初始酶活的54%。说明1000 EP-IPS具有较好的（甲醇、尿素、SDS、胰蛋白酶）耐受性和重复利用性。3.通过利用乙二胺（EDA）修饰和戊二醛活化的1000 EP固定IPS（1000EP-EDA-IPS）,优化了制备条件并研究了1000 EP-EDA-IPS的催化性能。结果表明,在5%乙二胺修饰2 h,0.25%戊二醛活化1 h,载体添加为400 mg,固定时间为12 h的条件下,1000 EP-EDA-IPS的最佳酶活回收率为87%,比优化前提高了9.5%。正置荧光显微镜与FTIR分析显示,IPS被成功固定在1000 EP-EDA上。1000 EP-EDA-IPS与1000 EP-IPS的最适催化温度都是80℃,但是游离IPS为90℃;1000 EP-EDA-IPS的最适催化p H与游离IPS保持一致;在p H值6.0条件下处理2 h,1000 EP-EDA-IPS能保留75.3%的初始酶活,但是游离酶则失活,在重复利用10次后,1000 EP-EDA-IPS能保留初始酶活的87%。因此,与1000 EP-IPS相比,1000 EP-EDA-IPS具有更高的酶活回收率、酸性耐受性和重复利用性。同时,研究了1000 EP-EDA-IPS生产肌醇的条件,结果显示,在6-磷酸葡萄糖二钠（G6P）浓度为3.5 g/L,1000 EP-EDA-IPS为240 mg,镁离子为15 m M,时间为10 h的条件下,肌醇产量为1.35 g/L。经16次循环利用后肌醇产量仍可以保持初始产量的37%。