论文部分内容阅读
[研究目的]microRNA(微小RNA, miRNA)是近年来发现的对基因具有调控作用,主要通过与靶基因的3’UTR区完全或不完全互补配对结合,而进行转录后水平负性调节其靶基因表达的一类小分子非编码RNA。越来越多的研究发现,某些miRNA具有癌基因或抑癌基因活性,在肿瘤发生和发展过程中发挥重要作用。但miRNA是否与胃腺癌发生、发展有关呢?本实验室已利用寡核苷酸微阵列技术,发现在人胃腺癌组织中miR-23a表达水平比正常胃组织中高。本课题进一步研究miR-23a对胃腺癌细胞生长增殖、凋亡及侵袭能力的影响,并确定miR-23a直接作用的靶基因,以阐明miR-23a在胃腺癌发生和发展中发挥的分子作用机制。[方法]首先,使用miR-23a ASO (ASO-23a)封闭内源性miR-23a的功能或转入pcDNA3/pri-23a过表达miR-23a后,运用MTT、平板克隆形成实验及软琼脂克隆形成实验观察miR-23a对胃腺癌细胞系MGC803增殖能力的影响,采用TUNEL实验观察miR-23a对胃腺癌细胞系MGC803凋亡的影响,采用transwell实验观察miR-23a对胃腺癌细胞系MGC803侵袭能力的影响。结合生物信息学方法和cDNA微阵列技术筛选miR-23a的候选靶基因,并利用双荧光报告载体实验验证niR-23a对靶基因的直接调控作用。并通过半定量RT-PCR、实时定量PCR及Western blot检测niR-23a功能受抑制或过表达miR-23a的胃腺癌细胞MGC803或胃腺癌组织中靶基因mRNA和/或蛋白水平的表达变化,进一步验证miR-23a对靶基因的调控作用。表达siRNA分别抑制MGC803中IL-6R.PPP2R5E或IRF1mRNA的表达后,通过MTT和平板克隆形成实验观察对胃腺癌细胞系MGC803细胞活性和克隆形成能力的影响。[结果]MiRNA芯片结果显示,在胃腺癌组织中miR-23a比正常胃组织中的表达明显上调。首先在MGC803细胞中,封闭miR-23a的功能后,细胞活性明显受抑制,且集落形成能力明显降低,而且细胞的非锚着生长能力也明显下降；相反,在MGC803细胞中,过表达miR-23a后,细胞生长加快,且集落形成能力增高,细胞的非锚着生长能力加强。使用ASO-23a封闭内源性miR-23a的功能或转入pcDNA3/pri-23a过表达miR-23a后,胃腺癌细胞系MGC803凋亡增加或减少,转移能力减弱或增强。双荧光报告载体实验证明,IL-6R、PPP2R5E和IRF1是miR-23a的候选靶基因,niR-23a能够通过作用于IL-6R、PPP2R5E和IRF1基因的3’非翻译区的特定结合位点,负性调节其表达。在miR-23a功能受抑制的胃腺癌细胞或正常胃组织中,IL-6R基因的mRNA表达水平和／或蛋白表达水平都有明显升高；在过表达miR-23a的胃腺癌细胞或胃腺癌组织中,IL-6R基因的mRNA表达水平和／或蛋白表达水平都有所下降。分别抑制MGC803中IL-6R、PPP2R5E或IRF1mRNA的表达后,胃腺癌细胞系MGC803细胞活性和克隆形成能力均加强。[结论]在胃腺癌中高表达的miR-23a可能通过下调IL-6R、PPP2R5E或IRF1的表达水平,导致细胞生长速度加快,凋亡减弱,转移能力增强。在胃腺癌细胞MGC803中,miR-23a可能起到癌基因的作用。通过阐明miR-23a作为癌基因在胃腺癌中的分子作用机制可以帮助我们对胃腺癌的发生和发展有更深一步的了解,同时也为胃腺癌的诊断和预后提供新的线索,为胃腺癌治疗新方法的研究提供一些参考。