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研究背景:外泌体(exosomes)是由细胞内的多囊泡体与细胞膜相融合,从而释放到细胞外的双层膜性纳米小囊泡。exosomes能够在细胞间传递生物活性物质,发挥重要的细胞间信息交流的作用。目前已有相关研究报道,原虫可以分泌exosomes,且在宿主与寄生虫间的信息交流方面发挥着重要作用。迄今,一些寄生虫,如日本血吸虫、布氏锥虫、克氏锥虫和新孢子虫,均被证实可以分泌exosomes。弓形虫是一种专性细胞内寄生的机会性致病原虫,具有生活史复杂且感染率高等特点,严重危害着人们的健康与畜牧业的发展。因此,探索有效预防或治疗手段来抵抗弓形虫感染刻不容缓。目前关于弓形虫来源的exosomes的相关研究仍较为有限。研究目的:分离、纯化和鉴定弓形虫ME49虫株来源的exosomes,并对弓形虫exosomes中非编码RNA进行分析,预测相关miRNA的宿主靶基因和靶定信号通路。进一步探究MAPK信号通路在弓形虫exosomes对宿主免疫应答的调控机制中的作用。研究方法:首先利用差速离心、超滤浓缩以及试剂盒提取相结合的方法,对弓形虫exosomes进行分离提取。并通过电子显微镜、纳米粒径分析仪(NTA)以及Western blotting等方法对所提取的囊泡结构进行鉴定。分析弓形虫exosomal非编码RNA的组分,利用二代高通量测序的方法对miRNA进行测序分析,并通过GO以及KEGG聚类分析预测宿主细胞靶基因及相关靶标信号通路。关于MAPK信号通路的探究,构建MAPK相关siRNA及选择合适MAPK抑制剂进行作用,通过实时定量PCR、Western blotting以及免疫荧光等方法检测磷酸化蛋白的表达水平,采用ELISA方法检测促炎性细胞因子的产生情况。结果:我们成功分离鉴定了弓形虫来源的exosomes。电镜结果显示所得为圆形囊状结构,直径范围约50-100 nm。纳米粒径分析结果表明其粒径分布范围是50-150 nm,平均粒径大小为88.7 nm,与经典的exosomes特征相吻合。Western blotting结果成功验证了 exosomes的标记蛋白Hsp70、CD63以及弓形虫标记蛋白P30。我们对弓形虫exosomes所包含的small RNA的成分进行了测定,在miRNA的高通量测序分析中,并找到潜在的与MAPK信号通路相关靶基因。在MAPK信号通路调控实验中,我们发现弓形虫exosomes能够通过活化JNK信号通路引起促炎性免疫应答,并能够产生高表达的促炎性细胞因子,而该调控机制与磷酸化JNK蛋白迁移入核现象具有相关性。结论:我们的研究结果清楚的展示了弓形虫exosomes能够介导磷酸化JNK蛋白的核转位现象。这些结果有利的支持了我们的假设,即弓形虫能够通过exosomes递呈信号分子给宿主细胞,可导致JNK信号通路的活化和磷酸化JNK蛋白迁移入核发挥其生物学作用。因此,弓形虫exosomes可作为宿主-病原体的相互作用中的关键调控因子。