基于差示扫描荧光法的乳清蛋白鉴别及乳铁蛋白定量检测研究

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乳清蛋白的种类和含量是乳及乳制品营养及商业价值的重要评价指标之一,因此其检测方法对于乳制品营养质量评估、乳源真伪鉴别以及乳制品加工工艺优化至关重要。已有的乳清蛋白鉴别检测方法,如电泳、色谱以及色谱-质谱等受成本、操作和仪器局限,仅能在实验室中进行,尚缺乏可用于生产实践的快速简便乳清蛋白检测技术。而差示扫描荧光检测技术(DSF)具有操作简便,检测快捷,样品用量少的突出优势。本研究基于DSF,以乳清蛋白本身的内源性荧光信号获取热稳定差异曲线,建立乳清蛋白鉴别检测方法,将其应用于不同热加工工艺乳的区分以及不同乳源的快速鉴别检测,并实现了乳制品中乳铁蛋白含量的特异性定量检测。具体研究和结果如下:(1)牛乳清蛋白的差示扫描荧光鉴别检测。采用β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、牛免疫球蛋白、牛血清白蛋白以及乳铁蛋白等五种乳清蛋白标品进行DSF分析,研究各乳清蛋白热稳定差异曲线特征提取及统计分析方法,建立五种牛乳清蛋白的鉴别检测方法,并将其用于不同热加工工艺乳制品的区分。结果显示,在蛋白浓度>0.2mg/mL,pH4.0-7.0的条件下,均可获取稳定的特征性熔解曲线,采用350nm的DSF曲线、350nm/330nm 比值的DSF曲线或者以上两种熔解曲线的熔解峰曲线,均可提取到具有显著差异性和特征性的熔解信息,结合数据分析处理准确鉴别了五种牛乳清蛋白,盲样检测准确率达到100%,通过提取乳清蛋白以克服具有内源荧光酪蛋白的干扰,成功实现不同热加工牛乳制品的区分。(2)不同来源乳的差示扫描荧光鉴别检测。进一步研究了不同物种来源乳的乳清蛋白热稳定性差异,发现它们的DSF熔解曲线相互独立且具有显著差异,据此建立了乳源真实性的快速鉴别检测方法。结果显示,在蛋白浓度>0.1 mg/mL,pH4.0-7.0的条件下,人源、牛源和羊源免疫球蛋白,人源、牛源和羊源乳铁蛋白,以及人源和牛源血清白蛋白标品的熔解曲线均具有显著性差异,表明不同来源乳清蛋白的热稳定性差异能够被DSF识别。当采用pH 4.1的醋酸缓冲溶液提取乳清蛋白以减少酪蛋白的干扰,并且乳清蛋白浓度高于1.0 mg/mL时,不同来源乳清蛋白中β-乳球蛋白的DSF熔解曲线差异显著,可以用于羊乳及驼乳中掺假牛乳的准确鉴别,并且掺假比例的检出限低至5%,表明该乳源真实性检测方法具有较强的实际应用潜力。(3)乳及乳制品中乳铁蛋白含量的差示扫描荧光检测。根据乳清蛋白中只有乳铁蛋白结合Fe3+后热稳定性显著提高,其熔解峰值由69℃升高至90℃这一特性,建立了乳铁蛋白含量的特异性定性和定量检测方法。结果显示,350 nm/330 nm比值的DSF熔解峰曲线比较适合于LF的定性,而350 nm的DSF熔解峰曲线则在LF定量检测时效果更佳。350 nm的DSF熔解峰面积与LF浓度之间呈现良好的线性关系,y=0.01794x-0.28011(R2=0.99825),LF在PBS缓冲液中的检出限为0.03mg/mL,但是在模拟乳清蛋白中则提高至0.2mg/mL,无法满足实际样品检测需求。通过预加热法无法去除乳品基体中其它热不稳定乳清蛋白的干扰,但是经肝素亲和柱前处理后,干扰则大幅度减少,成功实现了生牛乳、牛羊奶粉中LF的定量检测,加标回收率为70.05%-126.67%,结果与HPLC具有一致性。
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