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目的:肝癌为最常见的恶性肿瘤之一,严重危害着人类的健康,而肝癌的转移是影响肝癌患者生存期的首要因素,也是迫切需要解决的问题。人源DEPDC1(DEP domain containing 1)基因是近年来发现的一个原癌基因,报道显示DEPDC1基因在多种癌细胞中高表达并可促癌细胞转移。艾叶为菊科植物艾(Artemisia argyi Levl.et Vant)的干燥叶,艾叶挥发油(Artemisia argyi essential oil,AAEO)是艾叶的主要有效成分之一。课题组前期研究证实,AAEO具有抗肝癌细胞增殖活性及抗乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)活性,且预实验表明AAEO能够下调DEPDC1基因的表达。本实验将研究AAEO对肝癌细胞迁移与侵袭的影响及其机制,为进一步的AAEO抗肿瘤研究提供依据。方法:1.AAEO体外对肝癌细胞迁移与侵袭的抑制作用及其机制通过MTT法检测AAEO对人肝癌HepG2和SMMC-7721细胞的增殖抑制率,计算其半数抑制浓度(IC50)。选择合适浓度AAEO作用HepG2、SMMC-7721细胞48小时,采用划痕愈合实验,观察细胞的横向迁移能力变化;通过Transwell实验,观察细胞迁移侵袭能力变化。采用实时荧光定量PCR法(Quantitative Real-time PCR,qPCR)检测不同浓度AAEO对HepG2、SMMC-7721细胞中DEPDC1基因表达的影响;采用Western Blot检测细胞中DEPDC1蛋白、β-catenin蛋白和GSK-3β蛋白的表达变化。2.敲低细胞中DEPDC1基因表达对其介导的Wnt/β-catenin通路的影响慢病毒转染细胞,靶向沉默HepG2细胞中DEPDC1基因。采用qPCR方法检测细胞中DEPDC1基因及Wnt/β-catenin通路靶基因:Wnt-1、MMP9和β-catenin基因表达变化;采用Western Blot检测HepG2细胞中DEPDC1蛋白、β-catenin蛋白和GSK-3β蛋白的表达变化。3.AAEO体内对肝癌细胞转移的抑制作用及其机制构建荧光素标记的肝癌HepG2细胞株(Luc-HepG2),通过尾静脉注射Luc-HepG2细胞的方法构建肝癌肺转移裸鼠模型。将构建成功的模型裸鼠随机分为模型组(生理盐水 10 mL/kg)、AAEO高(230 mg/kg)、中(115 mg/kg)、低(57.5 mg/kg)剂量组、阳性对照组(索拉非尼40 mg/kg),连续给药21天。采用小动物活体成像仪观察。采用qPCR法检测AAEO对各组裸鼠肺组织中的DEPDC1基因表达的影响;免疫组化方法检测肺组织中β-catenin蛋白的表达变化。4.AAEO在大鼠体内的组织分布选择有效剂量的AAEO灌胃SD大鼠,采用GC法检测AAEO在心、肝、脾、肺、肾、脑组织中分布情况,从药代动力学角度阐明AAEO抑制肝癌转移的机制。结果:1.AAEO 作用 HepG2、SMMC-7721 细胞 72 小时,MTT 结果显示,AAEO对体外培养的肝癌HepG2、SMMC-7721细胞增殖具有明显的抑制作用,IC50分别为 321.73±3.82μg/mL 和 322.04±14.29μg/mL。AAEO 作用 HepG2、SMMC-7721细胞后,划痕愈合实验和Transwell实验显示AAEO能够有效抑制细胞的迁移侵袭,并具有明显的浓度依赖性。QPCR实验结果表明,AAEO下调细胞中DEPDC1基因表达;Western Blot结果显示,AAEO明显下调细胞中DEPDC1蛋白及β-catenin蛋白的表达,上调GSK-3β蛋白的表达。2.成功构建靶向沉默DEPDC1基因表达的HepG2(Ko-HepG2)细胞株。QPCR实验结果显示,沉默DEPDC1基因的表达后明显抑制了细胞中Wnt/β-catenin通路靶基因:Wnt-1、MMP9和β-catenin基因表达,明显下调细胞中DEPDC1蛋白及β-catenin蛋白的表达,上调GSK-3β蛋白的表达。以上实验结果表明,AAEO可以下调细胞中DEPDC1基因表达,从而阻断Wnt/β-catenin通路抑制肝癌细胞的迁移与侵袭。3.成功构建肝癌肺转移裸鼠模型。小动物活体成像结果直观的显示了AAEO可减少转移灶的形成,用药组癌细胞转移被明显的抑制,且具有浓度依赖性。随着给药时间的延长,模型组裸鼠出现活动减少、体重下降等现象;AAEO组裸鼠体重无明显变化。QPCR结果表明AAEO对裸鼠肺组织中的DEPDC1基因具有明显抑制作用;免疫组化结果显示AAEO组裸鼠肺组织中β-catenin蛋白的表达被抑制。4.建立了测定SD大鼠灌胃AAEO后各组织中AAEO主要成分桉油精含量的方法,该方法回收率较高,操作过程简便易行。组织分布结果显示AAEO灌胃给药后吸收较好,在肺、肝、脑等组织中含量较高。结论:1.AAEO体内、外对肝癌细胞的迁移与侵袭都具有明显的抑制作用。2.AAEO灌胃给药后吸收较好,能有效分布至肝脏和肺等转移组织。3.AAEO可以下调DEPDC1基因的表达,从而阻断Wnt/β-catenin通路抑制肝癌细胞的迁移与侵袭。