研究背景糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病导致的一种严重的心血管并发症,是由代谢紊乱引起的除外冠状动脉性心脏病、高血压性心脏病、心脏瓣膜病等其他心脏病变的心肌疾病。目前,DCM已成为导致糖尿病患者死亡的主要并发症,占总死亡率70%左右。早期DCM患者临床症状不显著,超声心动图检测可显示心脏舒张功能受损,病程后期可出现收缩功能障碍及充血性心力衰竭。研究表明,心室重构是导致DCM主要的病理机制,表现为心肌间质纤维化、心肌细胞肥大及心肌细胞凋亡。近年来,DCM的发病机制尚未完全明确,心肌细胞代谢紊乱、肾素-血管紧张素系统(RAS)激活、氧化应激、自噬、钙稳态失衡、胰岛素抵抗及炎症反应等被认为参与其发生和发展。其中RAS激活是诱导DCM心室结构重构的重要发病机制。经典的RAS主要通过调节外周血管收缩阻力来调控血容量及血压。近年来的研究发现,多种组织中存在RAS成员的表达,尤其是心脏内局部RAS的激活,可引起心脏结构重塑。RAS中重要的成员包括血管紧张素转化酶(ACE)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、血管紧张素Ⅱ 1型受体(AT1受体)、血管紧张素Ⅱ 2型受体(AT2受体)、血管紧张素转化酶2(ACE2)、血管紧张素(1-7)及血管紧张素(1-7)的Mas受体。RAS的平衡主要由ACE-AngⅡ-AT1受体轴和ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴来调节。AngⅡ作为RAS的核心成员,在DCM的胶原合成、细胞凋亡、氧化应激和炎症反应等过程都起到重要作用。众多研究表明缬沙坦作为AT1受体拮抗剂具有改善DCM心室重构的作用。另一些研究表明,ACE2作为ACE的同工酶降解AngⅡ生成Ang(1-7),过表达ACE2基因明显改善AngⅡ诱导的心室肥厚及纤维化且作用优于ARB。然而ACE2作为一种酶易被降解,具有不稳定的特点,因此,通过促进ACE2合成来抑制DCM心室重构有望成为新的治疗方式。转录因子CCAAT增强子结合蛋白β(C/EBPβ)是结合于DNA增强子的反式作用因子,属于亮氨酸拉链转录因子家族。C/EBPβ通过调节多种靶基因转录活性,影响细胞增殖与分化,调控细胞周期,调节癌细胞的生成与凋亡等。有研究表明,降低C/EBPβ表达水平,可以增加多种心肌肥厚相关基因的表达,如GATA相关蛋白4、a-肌球蛋白重链、肌钙蛋白T和T-box转录因子5等。在我们之前的研究中发现,C/EBPβ可结合于ACE2基因启动子序列并调控ACE2蛋白的表达,过表达C/EBPβ可上调动脉粥样硬化(AS)斑块内ACE2的表达,从而降低斑块易损性,抑制AS的进展。然而,对于C/EBPβ在DCM中的作用尚未报道。因此,本研究应用注射链脲佐菌素(STZ)的实验方法,建立1型糖尿病动物模型,探讨C/EBPβ在DCM中的表达及对RAS和心室重构的作用。研究目的1.研究C/EBPβ及RAS主要成员在糖尿病小鼠心肌组织中的表达水平;2.研究C/EBPβ基因过表达、干扰及缬沙坦给药对糖尿病小鼠心脏功能、心肌纤维化及心肌细胞凋亡的影响;3.比较过表达C/EBPβ与缬沙坦对DCM的作用。研究方法1.构建小鼠C/EBPβ慢病毒载体设计3对小鼠C/EBPβ基因siRNA序列,转染至小鼠原代心肌成纤维细胞(CFs)中,采用实时荧光定量PCR(qPCR)及蛋白免疫印迹法(Western blot)筛选出RNA及蛋白水平干扰效率最显著的siRNA序列,由公司依据所筛最优序列构建合成慢病毒载体,其中包含绿色荧光蛋白(GFP)报告基因,C/EBPβ过表达慢病毒由公司直接包装合成。2.糖尿病动物的建立及分组将100只8周龄雄性C57BL/6J小鼠(体重23±5g)随机分为糖尿病组(80只)和正常对照组(20只)。糖尿病组小鼠给予连续5天的腹腔内STZ-柠檬酸缓冲液注射,STZ剂量为50mg/kg,正常对照组(Control组)仅注射等体积柠檬酸缓冲液。一周后连续3天检测糖尿病组随机血糖,血糖大于16.7mmol/l被认为1型糖尿病模型已成功建立。于造模成功12周后,将糖尿病组小鼠随机进行分组,设立4组:糖尿病空载体对照组(DM + sh-N.C.)、糖尿病+ C/EBPβ基因过表达慢病毒组(DM + C/EBPβ)、糖尿病+ C/EBPβ基因干扰慢病毒组(DM+sh-C/EBPβ)、糖尿病+缬沙坦组(DM+valsartan)。其中空载体、过表达及干扰慢病毒转染通过小鼠尾静脉注射的方法,转染病毒滴度为每只小鼠1×107UT/30μl。缬沙坦组的糖尿病小鼠采用灌胃的方式给药,给药量为30mg/kg。小鼠于慢病毒转染和给药4周后行安乐死,留取心脏组织及血液并适当保存。实验期间采用尾静脉取血的方法,分别于STZ注射0周、1周、12周及16周取材前检测糖尿病小鼠随机血糖水平。采用鼠尾血压计于STZ注射0周、16周检测各组小鼠心率及血压水平。3.心脏功能检测STZ注射16周后,使用高分辨率小动物超声仪对小鼠心脏室壁厚度、左心室收缩及舒张功能进行检测和评价。4.组织形态学及免疫组织化学染色取材后的小鼠心脏组织使用4%多聚甲醛进行浸泡固定,并制备4.5μm石蜡切片,用于H&E染色及Masson染色。前者可观察心脏组织大体形态、心肌细胞形态、大小及排列,后者用于观察心肌间质胶原含量。应用免疫组织化学染色法,检测C/EBPβ、ACE2、ACE、胶原Ⅰ、胶原Ⅲ及转化生长因子β1(TGF-β1)的表达水平。5.血清酶联免疫吸附测定(ELISA)使用ELISA检测AngⅡ、Ang(1-7)在心肌组织及血清中表达水平,检测白介素-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的血清含量。6.蛋白质印迹实验(Western blot)提取小鼠左室心肌组织蛋白,用Western blot法检测C/EBPβ、ACE2、ACE、AT1受体、AT2受体、Mas受体、胶原 I、胶原 IⅢ、TGF-β1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Bax的表达水平。7.原代CFs的分离与培养本实验使用的原代CFs提取自1-3天的C57BL/6J乳鼠心脏并使用含10%胎牛血清的DMEM进行培养。8.实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)应用实时荧光定量qPCR技术测定siRNA干预后原代CFs中C/EBPβ的mRNA表达水平。9.统计学分析应用SPSS v18.0软件对所有数据结果进行统计分析,多组间比较采用one-way ANOVA检验,数据显示使用均数±标准差,p<0.05被认为具有统计学意义。研究结果1.C/EBPβ干预对糖尿病小鼠的血糖及血压水平无显著影响所有糖尿病小鼠随机血糖均显著高于正常对照小鼠,而4组糖尿病小鼠间血糖无统计学差异。各组小鼠之间血压亦无显著的统计学改变。2.C/EBPβ过表达显著改善糖尿病小鼠心室肥大和心功能障碍STZ注射16周后,糖尿病小鼠心脏重量(HW)和心身重量比(HW/BW)增加,心脏大小明显增加,H&E染色观察发现心肌结构异常,心肌细胞肥大,排列紊乱。与糖尿病空载体组相比,C/EBPβ过表达及缬沙坦给药组可显著改善心脏形态及心肌结构,并且C/EBPβ过表达的改善作用要优于缬沙坦组。C/EBPβ干扰组较空载体组无显著变化。与正常对照小鼠相比,4组糖尿病小鼠均出现不同程度的收缩与舒张功能障碍,其中左室射血分数(LVEF)、缩短分数(FS)和E/A显著降低,而左心室后壁厚度(LVPWd)增加,并且左心室舒张末内径(LVEDd)显著扩大。C/EBPβ过表达及缬沙坦治疗组可明显改善DCM的心功能异常,且C/EBPβ过表达作用更显著。C/EBPβ干扰组较空载体组无显著变化。3.C/EBPβ过表达显著改善糖尿病小鼠心肌组织纤维化心肌组织Masson染色显示,与正常组比,4组糖尿病小鼠间质中胶原表达显著增加,并且Western blot检测及免疫组织化学显示,心肌组织纤维化相关蛋白如胶原I、胶原Ⅱ和TGF-β1表达水平增加。与糖尿病空载体组比较,C/EBPβ基因过表达和缬沙坦治疗可以降低胶原的表达,而C/EBPβ干扰组无明显改变。Western blot检测显示,高血糖降低心肌组织MMP-2蛋白表达水平,C/EBPβ过表达和缬沙坦治疗可以增加MMP-2的表达从而降解心肌间质的胶原,C/EBPβ干扰组MMP-2蛋白水平较空载体组无统计学差异。各组小鼠间MMP-9表达水平无明显差异。与缬沙坦治疗组相比,C/EBPβ过表达组抑制胶原表达和促进胶原降解的能力更为显著。4.C/EBPβ过表达抑制糖尿病小鼠心肌细胞凋亡和炎症因子的分泌与正常组比,糖尿病空载体组的小鼠心脏组织中Bax/Bcl-2比值明显增加,提示心肌细胞凋亡水平增加。C/EBPβ过表达和缬沙坦治疗较糖尿病空载体处理比,可显著降低Bax/Bcl-2比值。有研究表明,AT2受体作为AngⅡ作用的另一受体,其表达水平的增加与细胞凋亡有关。相对于正常小鼠而言,糖尿病小鼠AT2受体明显增多。与糖尿病空载体组相比,增加C/EBPβ表达可以显著减少AT2受体的表达,而缬沙坦对AT2受体表达无明显作用。C/EBPβ干扰组较糖尿病空载体组无统计学差异。糖尿病小鼠血清IL-6和MCP-1水平明显增加。与糖尿病空载体组相比,C/EBPβ过表达组和缬沙坦治疗组可以降低血清炎症因子的水平,C/EBPβ干扰组较糖尿病空载体组的炎症因子水平无明显变化。5.C/EBPβ蛋白在糖尿病小鼠心肌组织中呈低水平表达与正常组比,糖尿病空载体组的小鼠心脏组织中C/EBPβ蛋白表达水平明显降低,C/EBPβ基因干扰慢病毒在C/EBPβ低水平表达的情况下不能进一步降低其表达,而过表达慢病毒可显著增加C/EBPβ蛋白表达。缬沙坦组C/EBPβ的表达较糖尿病空载体组无明显变化。6.C/EBPβ过表达上调糖尿病小鼠心肌组织中ACE2表达水平糖尿病空载体组心肌组织中的ACE2表达含量与正常组相比明显减少。与糖尿病空载体组相比,过表达C/EBPβ可以显著增加ACE2的表达,而C/EBPβ基因干扰组与缬沙坦治疗组ACE2表达含量无明显差别。7.C/EBPβ过表达降低糖尿病小鼠AngⅡ并增加Ang(1-7)含量糖尿病空载体组的小鼠心肌组织及血清中AngⅡ含量较正常组明显升高,而Ang(1-7)含量降低。与糖尿病空载体组相比,C/EBPβ过表达可降低AngⅡ含量并升高Ang(1-7)水平,而缬沙坦治疗可增加Ang(1-7)表达,但程度较C/EBPβ过表达低,并增加AngⅡ的含量。C/EBPβ干扰慢病毒处理较空载体组无明显变化。8.C/EBPβ过表达下调DCM心肌组织中ACE和AT1受体并上调Mas受体表达水平体内实验结果显示,高血糖上调ACE和AT1受体并下调Mas受体表达。与糖尿病空载体组相比,C/EBPβ过表达可逆转高血糖诱导的ACE、AT1受体及Mas受体表达变化,而缬沙坦处理后并无此作用。C/EBPβ干扰处理较空载体组无显著变化。研究结论1.1型糖尿病小鼠心肌组织中C/EBPβ蛋白表达水平明显减低;2.C/EBPβ基因过表达通过抑制心肌肥厚、纤维化、凋亡及炎症反应显著改善DCM心室重构及心功能;3.C/EBPβ基因过表达调控RAS主要成员在糖尿病小鼠心肌组织中的表达含量;4.C/EBPβ基因过表达对DCM的改善作用要明显优于缬沙坦治疗。研究背景糖尿病(DM)作为三大非传染性慢性疾病之一,已严重威胁人类健康,其致死率仅次于癌症、心血管疾病、感染及创伤等。1972年,Rubler等人发现一些心力衰竭患者除糖尿病之外并无其他致病因素,首次提出糖尿病性心肌病(DCM)这一概念。目前认为,DCM是在血糖升高的基础上,引起显著心脏结构改变和心功能减退,除外其他致心脏病变因素的心肌疾病。心室重构是DCM发生和发展的重要机制,研究表明,DM患者心脏重构的主要机制包括细胞内能量及物质代谢障碍,肾素-血管紧张素系统(RAS)过度激活,心脏微血管障碍及自主神经病变等。心肌组织的纤维化合并心肌细胞凋亡是DCM主要病理改变。作为高度分化的终末细胞,心肌细胞一般不能增殖,因此凋亡的心肌细胞被分泌增多的胶原替代,最终导致心肌组织纤维化和心功能障碍。因此,抑制心肌细胞凋亡及组织纤维化成为治疗DCM的关键环节。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)做为RAS中主要的效应因子之一,由血管紧张素转化酶(ACE)降解血管紧张素Ⅰ(Ang Ⅰ)生成,在组织中通过旁分泌、内分泌或者自分泌的方式影响细胞的生长,作用于心肌细胞时促进其肥大和凋亡,而作用于心肌成纤维细胞(CFs)时促进其增殖及细胞外基质的产生。血管紧张素转化酶2(ACE2)是一种具有抗增殖作用的保护性多肽,作为ACE的同系物,除了降解Ang Ⅰ生成Ang(1-9)外,其降解AngⅡ生成的主要产物Ang(1-7)具有多种心血管及其他靶器官的保护作用。在DCM中,Ang(1-7)通过作用于特异性Mas受体抑制AngⅡ诱导的胶原合成并可通过抑制NF-κB活性起心脏保护作用。研究报道,糖尿病大鼠受损的心功能及增多的心肌间质胶原在ACE2基因过表达30天后得到明显的改善,而敲除ACE2基因后,纤维化及心功能明显加重。ACE2作为一种不稳定的酶,并且Ang(1-7)作为小分子多肽,二者都具有易降解的特点,因此,通过促进ACE2上游转录因子的表达从而上调ACE2及Ang(1-7)表达可能成为治疗DCM的新靶点。转录因子CCAAT增强子结合蛋白β(C/EBPβ)是作用于DNA增强子的C/EBPs转录因子大家族重要成员之一。首次提出是发现其可结合白介-6(IL-6)基因启动子的白介-1(IL-1)效应元件。C/EBPβ在许多生物的多种组织中广泛存在并发挥多种生物学效应,如参与细胞的增殖及分化、能量代谢和炎症反应等。作为转录因子,其具有三个重要的功能域:富含脯氨酸的N端为转录激活域,C端bZIP结构域(DNA结合域)及形成亮氨酸拉链的二聚化功能域。C/EBPβ通过亮氨酸拉链与家族其他成员或者自身组成二聚体结构,增强与DNA启动子上磷酸基团的结合能力。我们前期在动脉粥样硬化(AS)模型的研究中发现,在ACE2基因-214到-163bβ的启动子活性区域中存在C/EBPβ结合位点。通过建立1型糖尿病动物模型,我们观察到过表达C/EBPβ具有改善糖尿病诱导的心室重构的作用并在DCM中调节RAS主要成员的表达。因此,本实验拟探究C/EBPβ在高糖刺激下CFs中的表达情况及其对CFs胶原合成和H9c2心肌细胞凋亡的影响,并探究高糖刺激下C/EBPβ调节RAS主要成员表达的作用机制。研究目的1.探究C/EBPβ基因干预对高糖刺激下CFs胶原合成及H9c2心肌细胞凋亡的影响;2.探究高糖刺激下C/EBPβ是否直接与ACE2启动子结合并调控ACE2表达;3.探究高糖刺激下C/EBPβ调节RAS主要成员表达的作用机制。研究方法1.siRNA-ACE2筛选及大鼠C/EBPβ基因过表达及干扰慢病毒构建分别设计3对小鼠及大鼠ACE2基因的siRNA序列,使用原代CFs和H9c2细胞进行干扰效率筛选,选出最优序列后进行细胞实验。由公司设计并直接构建3个大鼠C/EBPβ基因干扰慢病毒载体,应用qPCR及Western blot技术筛选出最优干扰序列以进行下一步实验。大鼠过表达C/EBPβ基因序列由公司直接设计并包装合成。2.细胞的分离、培养及分组2.1分离及培养提取自1-3天C57BL/6J乳鼠心脏中的原代CFs,使用糖浓度为5.5mM的含血清DMEM培养基进行培养,并使用浓度为33.3mM的葡萄糖对细胞进行高糖刺激。心肌细胞使用的是H9c2大鼠心肌细胞系。同时培养HeLa细胞进行染色质免疫沉淀实验。二者培养条件及刺激条件同原代CFs。2.2分组CFs和H9c2心肌细胞均被分为6组:①正常对照组(5.5 mM葡萄糖);②高渗组(5.5mM葡萄糖+ 27.5mM甘露醇);③高糖+慢病毒空载体对照组(HG + sh-N.C.);④高糖+C/EBPβ基因过表达慢病毒组(HG + C/EBPβ);⑤高糖+ sh-C/EBPβ基因干扰慢病毒组(HG + sh-C/EBPβ);⑥高糖+缬沙坦组(HG + valsartan)。CFs又分为三组:①慢病毒空载体+小干扰RNA空载体组(sh-N.C.+si-N.C.);②小干扰RNA空载体+C/EBPβ慢病毒过表达组(si-N.C.+C/EBPβ);③C/EBPβ慢病毒过表达+ACE2小干扰RNA组(C/EBPβ +siRNA-ACE2)。每组细胞均接受高糖刺激。HeLa细胞被分为2组:①正常对照组(5.5 mM葡萄糖);②高糖刺激组(33.3mM的葡萄糖)。3.实时荧光定量PCR(qPCR)提取并逆转录mRNA,检测siRNA-ACE2干扰效率。4.免疫印迹实验(Western blot)应用Western blot方法检测各组原代CFs中C/EBPβ、ACE2、ACE、AT1受体、Mas受体、胶原Ⅰ、胶原Ⅲ、TGF-β1、MMP-2、MMP-9的表达水平,检测各组H9c2大鼠心肌细胞中Bcl-2、Bax及AT2受体的表达水平。5.明胶酶谱实验应用明胶酶谱法测定CFs中MMP-2及MMP-9的酶活性。6.染色质免疫沉淀实验(ChIP assay)应用微球菌核酸酶及超声仪将高糖刺激下的HeLa细胞染色质打碎成小片段,使用C/EBPβ抗体富集目的蛋白结合的DNA片段,并使用ACE2引物进行PCR扩增,检测C/EBPβ与ACE2启动子片段的结合作用。7.统计学分析数据结果以均数±标准差表示。使用SPSS v18.0软件对结果进行分析,两组间数据采用独立t检验进行比较,而多组间数据采用one-way ANOVA检验进行比较。p<0.05时差异被认为具有统计学意义。研究结果1.C/EBPβ基因过表达显著抑制高糖刺激下CFs胶原的合成与正常组细胞相比,高糖诱导增加CFs胶原Ⅰ、Ⅲ及TGF-β1的合成。与高糖空载体组相比,转染C/EBPβ基因过表达慢病毒或缬沙坦处理可明显抑制CFs中胶原及胶原相关蛋白合成,并且C/EBPβ基因过表达抑制胶原合成的作用要优于缬沙坦刺激。C/EBPβ基因干扰与空载体组相比无显著差异。2.C/EBPβ基因过表达增加高糖刺激下CFs中MMP-2的表达水平及酶活性MMP-2蛋白表达水平及酶活性在高糖诱导的CFs中呈下调状态。与高糖空载体对照相比,C/EBPβ基因过表达慢病毒组和缬沙坦处理组显著上调其表达含量及酶活性,且过表达C/EBPβ对MMP-2表达影响更显著,而对其活性改变与缬沙坦相同。C/EBPβ基因干扰组较空载体组无显著改变。各组MMP-9蛋白表达含量及酶活性均无显著差异。3.C/EBPβ基因过表达可明显缓解高糖触发的H9c2心肌细胞凋亡从Western blot结果可以看出,与正常组比,Bax/Bcl-2比值及AT2受体在高糖刺激下的H9c2心肌细胞中表达上调。与高糖空载体对照组比,增加C/EBPβ表达能显著下调Bax/Bcl-2比值及AT2受体含量,缬沙坦刺激仅降低Bax/Bcl-2比值而对AT2受体表达无明显作用,C/EBPβ基因干扰组无显著改变。4.高糖刺激降低CFs中C/EBPβ的表达高糖刺激原代CFs48小时后,C/EBPβ蛋白表达含量显著降低,并且,与高糖空载体对照组相比,转染C/EBPβ基因过表达慢病毒可明显增加C/EBPβ表达,而转染sh-C/EBPβ干扰慢病毒在高糖刺激下并不能显著降低其蛋白表达,缬沙坦处理组与高糖空载体组相比无统计学差异。5.在高糖刺激下C/EBPβ基因过表达显著上调ACE2蛋白水平在高糖刺激下,ACE2的表达含量明显下降。与高糖空载体对照相比,C/EBPβ基因过表达可显著上调ACE2表达,而缬沙坦刺激和C/EBPβ基因干扰对ACE2蛋白表达无明显影响。6.过表达C/EBPβ抑制高糖诱导的ACE和AT1受体表达并上调Mas受体表达细胞实验表明,高糖诱导可增加CFs合成ACE及AT1受体,同时减少Mas受体表达。与高糖空载体对照组相比,C/EBPβ基因过表达可缓解ACE、AT1受体、Mas受体的表达变化,而缬沙坦刺激对三者均无明显影响。C/EBPβ基因干扰组较空载体无显著改变。7.C/EBPβ通过调控ACE2表达调节高糖诱导的胶原合成及凋亡Western blot结果显示,在高糖刺激下单独过表达C/EBPβ基因可引起C/EBPβ及ACE2蛋白表达的增加,减少胶原Ⅲ、TGF-β1的合成并降低心肌细胞Bax/Bcl-2比值。同时转染C/EBPβ基因过表达慢病毒和ACE2小干扰RNA,增加了 C/EBPβ表达并抑制了 ACE2表达,导致胶原相关蛋白的合成及心肌细胞凋亡显著增加。因此,我们认为C/EBPβ调节高糖诱导的胶原合成及凋亡是通过调控ACE2蛋白表达而发挥作用。8.C/EBPβ通过与ACE2启动子序列结合调节高糖诱导的胶原合成及心肌细胞凋亡染色质免疫沉淀结果显示,高糖刺激下,ACE2启动子序列可以与有C/EBPβ抗体的DNA免疫沉淀反应物结合,表明C/EBPβ结合并作用于ACE2启动子活性序列。并且高糖可抑制C/EBPβ与ACE2启动子活性序列的结合能力。研究结论1.C/EBPβ基因过表达可以减少高糖诱导的胶原合成及心肌细胞凋亡;2.高糖刺激下过表达C/EBPβ通过上调ACE2表达含量抑制胶原合成及心肌细胞凋亡,并通过降低AngⅡ和增加Ang(1-7)下调ACE-AngⅡ-AT1受体轴,上调ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴;3.在高糖刺激下,C/EBPβ通过结合ACE2启动子活性序列调控ACE2表达,从而调节胶原合成及凋亡水平;4.过表达C/EBPβ改善CFs胶原合成及心肌细胞凋亡的效果优于缬沙坦治疗。