论文部分内容阅读
目的:动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病。近年来发现细胞焦亡参与了动脉粥样硬化的病理过程。研究显示,lncRNA MALAT1与细胞焦亡相关,但其机制尚未完全阐明。因此,本研究旨在探讨lncRNA MALAT1在血管内皮细胞焦亡中的作用及调控机制,为进一步阐明动脉粥样硬化的病理机制奠定基础。方法:1.10 ng/m L TNF-α刺激内皮细胞24 h构建内皮细胞焦亡模型。显微镜下观察细胞形态;LDH检测试剂盒检测细胞LDH释放水平;Western blot检测细胞焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase-1和IL-1β表达水平;Hoechst 33342/PI染色检测PI阳性细胞百分比。2.探究lncRNA MALAT1在TNF-α诱导的内皮细胞焦亡中的作用。q RT-PCR检测TNF-α处理后内皮细胞MALAT1表达;q RT-PCR筛选MALAT1si RNA序列;内皮细胞转染si MALAT1再用TNF-α处理,通过LDH、Western blot以及Hoechst 33342/PI染色实验分别检测细胞LDH释放、焦亡相关蛋白表达水平和PI阳性细胞百分比。3.验证lncRNA MALAT1靶向miR-30c-5p。Pubmed查询MALAT1与miR-30c-5p的结合位点;双荧光素酶报告基因检测验证MALAT1与miR-30c-5p的靶向关系;q RT-PCR检测内皮细胞TNF-α处理、转染si MALAT1再用TNF-α处理后miR-30c-5p表达水平。4.探究miR-30c-5p在TNF-α诱导的内皮细胞焦亡中的作用。内皮细胞转染miR-30c-5p mimic进行预处理再用TNF-α刺激,通过q RT-PCR、LDH、Western blot以及Hoechst 33342/PI染色实验分别检测细胞miR-30c-5p表达、LDH释放、焦亡相关蛋白表达水平和PI阳性细胞百分比。5.验证miR-30c-5p靶向Cx43。Target Scan预测miR-30c-5p与Cx43的潜在结合位点;双荧光素酶报告基因检测验证miR-30c-5p与Cx43的靶向关系;Western blot检测内皮细胞TNF-α处理、经miR-30c-5p mimic/inhibitor预处理再用TNF-α刺激后Cx43表达水平。6.探究Cx43在TNF-α诱导的内皮细胞焦亡中的作用。内皮细胞转染si Cx43后用TNF-α处理,q RT-PCR和Western blot检测Cx43表达水平,LDH、Western blot以及Hoechst 33342/PI染色实验分别检测LDH释放、焦亡相关蛋白表达水平和PI阳性细胞百分比。7.验证lncRNA MALAT1/miR-30c-5p/Cx43轴在内皮细胞焦亡中的作用。内皮细胞共转染si MALAT1和miR-30c-5p inhibitor再用TNF-α处理,Western blot检测Cx43表达水平,LDH检测试剂盒检测LDH释放,Western blot检测焦亡相关蛋白表达水平,Hoechst 33342/PI双染检测PI阳性细胞百分比。结果:1.TNF-α刺激内皮细胞24 h,结果显示:细胞形态发生改变,细胞膜出现大气泡;LDH释放明显增加（p＜0.01）;焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase-1和IL-1β表达明显上升（p＜0.01）;PI阳性细胞百分比显著升高（p＜0.001）。2.TNF-α处理后内皮细胞MALAT1表达明显上升（p＜0.01）;筛选MALAT1si RNA序列,序列1沉默效果最好（p＜0.0001）;内皮细胞转染si MALAT1再用TNF-α处理,结果发现:si MALAT1能显著抑制TNF-α引起的LDH释放增加（p＜0.001）、焦亡相关蛋白表达上升（p＜0.05）、以及PI阳性细胞百分比升高（p＜0.05）。3.MALAT1与miR-30c-5p有结合位点;过表达miR-30c-5p使MALAT1野生型质粒荧光素酶活性明显降低（p＜0.01）;TNF-α处理后内皮细胞miR-30c-5p表达明显下降（p＜0.01）;转染si MALAT1能显著抑制TNF-α诱导的内皮细胞miR-30c-5p表达下降（p＜0.05）。4.内皮细胞转染miR-30c-5p mimic再用TNF-α刺激,结果表明:与mimic NC+TNF-α组相比,miR-30c-5p mimic+TNF-α组内皮细胞miR-30c-5p表达明显升高（p＜0.001）、LDH释放显著减少（p＜0.01）、焦亡相关蛋白表达明显下降（p＜0.05）、PI阳性细胞百分比显著降低（p＜0.05）。5.Target Scan预测发现miR-30c-5p与Cx43有潜在结合位点;过表达miR-30c-5p能使Cx43野生型质粒荧光素酶活性明显减弱（p＜0.01）;TNF-α处理后内皮细胞Cx43表达显著上升（p＜0.01）;内皮细胞转染miR-30c-5p mimic/inhibitor再用TNF-α处理,结果发现:miR-30c-5p mimic预处理明显降低Cx43表达（p＜0.05）,而miR-30c-5p inhibitor预处理显著升高Cx43表达（p＜0.05）。6.内皮细胞转染si Cx43再用TNF-α处理,结果显示:与si NC+TNF-α组相比,si Cx43+TNF-α组内皮细胞Cx43表达水平明显下降（p＜0.05）、LDH释放显著减少（p＜0.05）、焦亡相关蛋白表达明显下降（p＜0.05）、PI阳性细胞百分比显著降低（p＜0.05）。7.转染si MALAT1后内皮细胞Cx43表达水平明显下降（p＜0.01）,共转染si MALAT1和miR-30c-5p inhibitor使Cx43表达显著升高（p＜0.05）;同时共转染si MALAT1和miR-30c-5p inhibitor能逆转si MALAT1对内皮细胞焦亡的作用,导致LDH释放明显增加（p＜0.05）、焦亡相关蛋白表达明显上升（p＜0.05）、以及PI阳性细胞百分比显著升高（p＜0.05）。结论:LncRNA MALAT1在TNF-α诱导的内皮细胞焦亡中表达显著上升,下调lncRNA MALAT1可能通过miR-30c-5p/Cx43轴抑制TNF-α诱导的内皮细胞焦亡。